1、本課題將從臨床觀察持續(xù)性非臥床腹膜透析(CAPD)患者腹膜透析液內皮素一1(endothelin一1，盯一1)水平，并從細胞水平探討局部內皮素系統(tǒng)在腹膜纖維化形成中的作用機制，通過體外實驗應用非選擇性內皮素受體拮抗劑(ETA／ETB受體拮抗劑PDl42893)對腹膜間皮細胞進行干預，研究腹膜局部內皮素系統(tǒng)在腹膜纖維化形成中的作用，探討腹膜纖維化的發(fā)生機制及治療策略。 研究方法：1．在本院定期隨訪的CAPD患者中選取26例患者，放

2、免法測定透析液及血漿中ET一1的表達，通過腹膜平衡試驗(PET)確定患者腹膜轉運類型，記錄超濾量。通過Pearson相關分析，單因素方差分析和線性回歸方程，分析血漿與腹透液ET-1的表達和意義。以人腹膜間皮細胞株(HMrSV5)為研究對象，采用放免法、免疫細胞化學檢測不同時間、不同濃度的葡萄糖、甘露醇作用下人腹膜間皮細胞(peritonealmesothelialcell，HPMC)分泌的ET一1水平。采用半定量逆轉錄多聚酶鏈反應(RT

3、一PCR)檢測局部內皮素系統(tǒng)ET一1、內皮素受體(ETAR、ETBR)及內皮素轉化酶(ECE)的基因表達。2．相差顯微鏡下觀察HPMC細胞的形態(tài)改變，免疫細胞化學觀察細胞角蛋白(CK)、波形蛋白的表達。氚標胸腺嘧啶核苷滲入法測定細胞增殖，流式細胞術檢測細胞周期。乳酸脫氫酶(LDH)測定細胞損傷。3．采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放免法檢測不同濃度的葡萄糖、ET一1作用下IV型膠原(ColIV)、纖連蛋白(Fn)及轉化生長因子一β1

4、(TGF—B1)、白介素一1β(IL一1B)蛋白水平，RT一PCR檢測ColIV、Fn、基質金屬蛋白酶一2(MMP一2)基因表達，并在高糖和ET-1基礎上加入非選擇性內皮素受體拮抗劑(PDl42893)，觀察上述指標的變化。免疫印跡法(Westernblot)檢測p38MAPK、磷酸化p38MAPK(P—p38MAPK)蛋白水平。 研究結果：1．透析液中ET一l的實測值明顯高于預測值(P

5、析液ET-1的濃度、內皮素透析液血漿比值(D／PET-1)各組間均無顯著差異(P>O．05)。凈超濾量與透析液ET一1的濃度呈負相關。正常HPMC分泌低水平的ET一1，高濃度的葡萄糖可誘導HPMC分泌盯一1增加，呈時間和劑量依賴。HPMC表達完整的盯一1、ETAR、ETBR、ECEmRNA。高糖作用下盯一1、ETAR、ETBRmRNA表達增強。2．ET-1作用下，HPMC出現(xiàn)梭形改變，CK8和波形蛋白仍為強陽性表達。ET一1促進HPMC

6、細胞DNA合成，呈劑量依賴。ET一l增加HPMC的損傷。3．ET-1促進HPMC分泌Col工V、Fn及ColIV、Fn、MMP一2mRNA的表達。PDl42893可下調高糖誘導的ColIV、Fn和MMP一2。ET一1刺激HPMC分泌TGF一131、工L一113，呈劑量依賴。高糖和ET-1可激活HPMC細胞的p38MAPK信號通路，而PDl42893通過阻斷ET一1的作用，部分抑制高糖激活的p38MAPK信號通路。 結論：1．腹腔

7、盯一1可能部分來源于腹腔局部自分泌和旁分泌，腹膜超濾功能受損可能與腹腔盯一1水平有關。人腹膜間皮細胞存在內皮素系統(tǒng)，高濃度葡萄糖誘導其表達增加，HPMC可能是腹膜局部內皮素一1的來源之一。2．ET-1對HPMC有促收縮作用，促增殖作用，同時加重HPMC損傷。ET一l未使HPMC發(fā)生表型轉化。3．ET-1有促HPMC細胞外基質形成作用。ET一1誘導的ECM的形成可能與致纖維化因子TGF-β1的途徑有關。盯一1有促炎癥作用，進一步促進ECM