1、腹膜纖維化是腹膜透析(peritonealdialysis,PD)的主要并發(fā)癥，很大程度上影響著腹膜透析作為長期腎臟替代治療的效果[1]，而腹膜間皮細(xì)胞(Humanperitonealmesothelialcells,HPMCs)發(fā)生的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Epithelial-to-mesenchymaltransition,EMT）被認(rèn)為是腹膜纖維化的最初反應(yīng)，也是腹膜透析早期相關(guān)性損害的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。發(fā)生腹膜纖維化時，間皮細(xì)胞

2、下出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的積聚[3]。腹膜的EMT和纖維化與其他器官和組織如肺、心、腎、胸膜有類似的病理改變[4-5]。在EMT的過程中，可發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志分子逐漸下調(diào)并消失，而間皮細(xì)胞標(biāo)志分子逐漸上調(diào)[6]。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Snail,Zeb和HLH家族在E-cadherin以及參與EMT過程的基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)過程中起著重要的作用[7]，但是目前研究發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子尚不能完全解釋腹膜EMT的分子機制，還有待于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的

3、更重要的轉(zhuǎn)錄因子。有研究報道，血清反應(yīng)因子（Serumresponsefactor,SRF)在腫瘤進(jìn)展過程中起著重要的作用，特別是在上皮性腫瘤EMT中呈現(xiàn)高表達(dá)并且有很高的活性[8]，但是SRF在腹膜間皮細(xì)胞的EMT過程中發(fā)揮著怎樣的作用尚不清楚。本課題對此問題進(jìn)行了一系列研究。
　　【目的】
　　1.SRF在原代以及高糖刺激永生化的腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT后的表達(dá)及其作用。
　　2.SRF在腹膜透析動物模型中的表達(dá)及其

4、作用。
　　【方法】
　　1.將腹膜透析液離心后進(jìn)行HPMCs培養(yǎng)，觀察不同透析時間（透齡）原代HPMCs細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光化學(xué)的方法檢測上皮標(biāo)志分子E-cadherinh、間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail以及SRF的表達(dá)和細(xì)胞定位情況。
　　2.通過高糖刺激永生化的HPMCs，建立腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞模型，觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并采用Western-blot方法和免疫細(xì)胞化學(xué)熒光的方法檢測

5、上皮標(biāo)志分子E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)。
　　3.應(yīng)用Westernblot方法和免疫細(xì)胞熒光化學(xué)的方法檢測SRF在未發(fā)生轉(zhuǎn)分化和已發(fā)生轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞中的表達(dá)差異和細(xì)胞定位，同時檢測SRF的活性形式即磷酸化SRF的表達(dá)。
　　4.將SRF特異性上調(diào)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒（由Dr.EricOlson,DepartmentofMolecularBiology,UTSouthwesternMedicalC

6、enteratDallas,USA饋贈）轉(zhuǎn)染腹膜間皮細(xì)胞，檢測在SRF上調(diào)時上皮標(biāo)志分子E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)。
　　5.將SRF特異性下調(diào)病毒轉(zhuǎn)染到高糖刺激發(fā)生了轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞中，分別采用Westernblot方法和免疫細(xì)胞熒光化學(xué)的方法檢測在SRF下調(diào)時上皮標(biāo)志分子E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)。
　　6.SD大鼠腹腔內(nèi)注射高糖透析液，建立高糖誘導(dǎo)大鼠

7、腹膜纖維化模型，HE染色檢測大鼠腹膜的厚度；采用免疫組織化學(xué)的方法檢測上皮標(biāo)志分子E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)以及SRF的表達(dá)及細(xì)胞定位情況。
　　7.SRF特異性的抑制劑（CCG-1423）溶入高糖透析液中進(jìn)行大鼠腹腔灌注，HE染色檢測大鼠腹膜的厚度；采用免疫組織化學(xué)的方法檢測上皮標(biāo)志分子E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail以及SRF的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1

8、．SRF在人腹膜透析液HPMCs原代細(xì)胞中高表達(dá)，以及在高糖刺激永生化HPMCs發(fā)生轉(zhuǎn)分化后高表達(dá)
　　收集40例PD患者無菌夜間留腹PD液標(biāo)本，離心后進(jìn)行HPMCs原代培養(yǎng)，隨著透齡的延長，細(xì)胞由鵝卵石樣逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維樣；免疫細(xì)胞化學(xué)熒光顯示SRF由胞膜、胞質(zhì)表達(dá)逐漸定位至胞核，并且SRF的表達(dá)也顯著增強，與上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與間質(zhì)標(biāo)志α-SMA、Snail的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　利用60mmo

9、l/L高糖在不同時間（0d、1d、2d、4d、7d）刺激人腹膜間皮細(xì)胞，與對照組5.6mmol/L相比,應(yīng)用Western-blot顯示SRF蛋白水平明顯增高，并且呈現(xiàn)時間依賴性，與上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)呈正相關(guān)；免疫細(xì)胞化學(xué)熒光顯示SRF的表達(dá)也是逐漸增強的，并且出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。
　　2．體外實驗證實SRF可以促進(jìn)人腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化
　　永生化的HP

10、MCs轉(zhuǎn)染SRF上調(diào)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒后，與對照組相比，Western-blot顯示SRF的蛋白水平增高，上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)下降，而間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)明顯升高，與SRF的表達(dá)呈正相關(guān)；免疫細(xì)胞熒光顯示在上調(diào)SRF表達(dá)組，其上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)明顯減弱，而間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)明顯增強；
　　高糖刺激永生化的HPMCs72h使其發(fā)生轉(zhuǎn)分化后，轉(zhuǎn)染下調(diào)SRF的慢病毒

11、和對照病毒，與對照組相比，Western-blot顯示SRF的表達(dá)水平降低時，上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)升高，而間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA和Snail的表達(dá)明顯減少；免疫細(xì)胞熒光顯示在下調(diào)SRF組的HPMCs中，上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)明顯增強，而間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA和Snail的表達(dá)明顯減弱。
　　3．動物體內(nèi)試驗證實SRF抑制劑可以減輕腹膜纖維化
　　腹腔內(nèi)灌注高糖透析液建立腹膜纖維化動物模型，與對照

12、組（腹腔灌注生理鹽水）相比，HE染色切片顯示大鼠腹膜的厚度明顯增厚，免疫組化顯示SRF表達(dá)明顯增加，主要位于細(xì)胞核表達(dá)，上皮標(biāo)分子志E-cadherin表達(dá)明顯減弱，而間質(zhì)標(biāo)志分子α-SMA、Snail的表達(dá)明顯增強；
　　在SRF抑制劑組（CCG-1423加入高糖透析液）中，與腹膜纖維化組相比，HE染色顯示，腹膜的厚度明顯變??；免疫組化顯示SRF的表達(dá)也顯著減弱，而上皮標(biāo)志E-cadherin表達(dá)明顯增強，而間質(zhì)標(biāo)志α-SMA、