1、目的：
　　 近年來，隨著競技體育的飛速發(fā)展和全民健身運動的廣泛開展以及生活壓力增大，鍛煉人數(shù)越來越多，運動量日益加大，運動性猝死事件不斷發(fā)生，其死因85％以上是心源性猝死，且相當(dāng)一部分猝死出現(xiàn)在運動結(jié)束之后。為此，長時間劇烈運動或過度運動對心臟產(chǎn)生不良影響的嚴重醫(yī)學(xué)問題以及全民應(yīng)該如何更為健康地運動成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擬觀察經(jīng)一周反復(fù)力竭性運動結(jié)束后恢復(fù)期不同時間點（運動后即刻、3h、6h、12h

2、、24h、48h和96h）大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變以及大鼠血清和心肌組織中TNF-α、NF-κB、ICAM-1等炎性因子和細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律;同時研究苦苣提取物3.2g/kg（按生藥計）和1.6g/kg對大鼠力竭性游泳運動后24h和48h心肌組織病理學(xué)改變以及血清和心肌組織中TNF-α、NF-κB、ICAM-1等炎性因子和細胞凋亡的影響，以探討運動延遲性心肌損傷的炎性產(chǎn)生機制和苦苣提取物的干預(yù)作用，為預(yù)防運動性猝死的發(fā)生和運動性心肌損傷

3、的康復(fù)治療提供重要的實驗理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.運動延遲性心肌損傷模型的建立采用經(jīng)典的Thomas的方法通過反復(fù)力竭性游泳運動建立延遲性心肌損傷實驗動物模型。力竭性游泳運動采用尾部負重2％體重的負荷，每天游泳至力竭狀態(tài)，連續(xù)1周（7天）。力竭標(biāo)準(zhǔn)采用“經(jīng)過10秒后動物仍不能返回水面為標(biāo)準(zhǔn)”[1]。
　　 2.動物分組及給藥將262只健康雄性SD大鼠隨機分為安靜對照組(SC，35只)、力竭性運動模型組（

4、M，155只）和苦苣提取物治療組（D，72只）。安靜對照組大鼠不進行任何運動直接取材;模型組大鼠進行通過反復(fù)力竭性游泳運動。運動模型組根據(jù)運動后恢復(fù)時間不同又分為運動后即刻組(st)、3h組、6h組、12h組、24h組、48h組和96h組（每組分別為20、17、17、17、17、35、35、17只），運動結(jié)束后按不同時間點取材;苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg給藥組又各自分為給藥24h組和48h組（每組18只）。苦苣提取物給藥2

5、4h組分別于運動后即刻和運動后23h給藥一次，末次給藥后1h取材;給藥48h組分別于運動后即刻、24h、47h給藥1次，于末次給藥后1h取材。
　　 3.取材及觀察指標(biāo)①各組大鼠分別于運動結(jié)束后相應(yīng)時間點觀察大鼠身體的一般狀況并稱體重(Body weight，BW)，計算體重變化百分率。
　　 ②各組大鼠分別自頸靜脈竇取血2ml，制備血清，-20℃保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunos

6、orbent assay，ELISA）法檢測大鼠血清中TNF-α、NF-κ B和ICAM-1含量以及cTnI含量，全自動生化分析儀檢測血清中心肌酶譜CK、CK-MB含量。
　　 ③處死動物，迅速取出心臟并稱重，計算心臟系數(shù)。
　　 ④心臟用4℃冷生理鹽水清洗后，切取左心室部分肌組織約100mg，制備10％心肌組織勻漿，離心取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?，采用ELISA法檢測大鼠心肌組織中的NF-κB、TNF-α、ICAM-1

7、含量。
　　 ⑤安靜對照組和模型組每組各取2只大鼠心肌組織做電鏡，觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 ⑥每組各取5只大鼠剩余心肌放入福爾馬林中固定三天后，取左心室心肌組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，備用，經(jīng)木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosinstaining，HE stain)觀察心肌組織病理學(xué)改變;免疫組織化學(xué)方法檢測心肌組織中NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表達水平和細胞凋亡。
　　 ⑦各

8、組另取5只大鼠心肌組織兩塊各約100mg，用液氮迅速制備心肌冰凍標(biāo)本，-70℃保存?zhèn)溆?，采用免疫印跡(Western blotting)檢測心肌組織中NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表達水平;實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timefluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)檢測心肌組織中TNF-αmRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA基因表達水平。
　　 ⑧采用心臟灌流酶

9、消化法制備分離心肌細胞，經(jīng)Hoechst33325染色觀察苦苣提取物對大鼠心肌細胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠一般狀況、體重及心臟系數(shù)
　　 (1)與安靜對照組比較，力竭性運動模型組大鼠游泳結(jié)束后普遍會出現(xiàn)呼吸急促、嗜睡，部分大鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，游泳到第5～7天，狀態(tài)明顯下降，游泳時間縮短，皮毛光潔度差，對外界的反應(yīng)遲緩，豎毛、皮毛脫落等?？嘬奶崛∥?.2g/kg可以明顯改善上述狀況。
　　

10、(2)與安靜對照組比較，反復(fù)力竭性運動模型組各組大鼠體重均具有不同程度的明顯減輕(P＜0.05和P＜0.01)，其中以運動后24h和96h組體重減輕最大(P＜0.01);苦苣提取物3.2g/kg、1.6g/kg給藥24h組和48h組大鼠體重均有明顯增加。
　　 (3)與安靜對照組比較，反復(fù)力竭性運動后即刻、6h、48h組大鼠的心臟系數(shù)均有顯著增加(P＜0.05和P＜0.01);苦苣提取物3.2g/kg、1.6g/kg給藥后48h

11、組與運動后48h組比較心臟系數(shù)均明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2.苦苣提取物對大鼠血清中心肌酶譜CK和CK-MB的影響與安靜對照組比較，反復(fù)力竭性運動后24 h和48h組大鼠血清CK和CK-MB活性皆有明顯增加(P＜0.05和P＜0.01)，苦苣提取物小劑量給藥24h組大鼠血清CK和CK-MB活性均有所降低，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組和48h組以及1.6g/kg給

12、藥48h組大鼠血清CK和CK-MB活性均明顯降低(P＜0.05和P＜0.01)。
　　 3.力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)改變及苦苣提取物的干預(yù)作用
　　 (1)電鏡下觀察到安靜對照組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)正常。反復(fù)力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的損傷;其中以運動后48h為最嚴重。
　　 (2)光學(xué)顯微鏡下觀察到安靜對照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常。力竭性運動后24h組和48h組大

13、鼠心肌組織均出現(xiàn)局部肌細胞排列不規(guī)則，橫紋不清晰，核增大，散在點灶狀炎癥壞死等病理改變外，48h多數(shù)肌細胞發(fā)生溶解性壞死?？嘬奶崛∥?.2g/kg給藥24h組以及苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg給藥48h組大鼠心肌組織均有所改善。
　　 4.力竭性運動后不同時相大鼠血清中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1含量的動態(tài)變化及苦苣提取物的干預(yù)作用——ELISA法
　　 (1)與安靜對照組比較，反復(fù)力竭性運動后24h

14、和48h組血清中TNF-α濃度顯著升高(P＜0.05)，其余各組均有升高趨勢，TNF-α濃度高峰出現(xiàn)在運動后24h;運動后即刻、3h和6h組大鼠血清中NF-κB濃度均明顯降低(P＜0.01和P＜0.05)，而運動后12h、24h、48h和96h組NF-κB濃度均顯著升高(P＜0.01)，24h達高峰，呈現(xiàn)先低后高走勢;運動后12h、24h、48h和96h組大鼠血清中ICAM-1濃度均明顯增加(P＜0.01和P＜0.05)，運動后即刻～6

15、h血清中ICAM-1無明顯變化(P＞0.05)，峰值出現(xiàn)在運動后96h。
　　 (2)與力竭性運動后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組大鼠血清中TNF-α、NF-κB和ICAM-1濃度均顯著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg使大鼠血清NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05);與運動后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組均使大鼠血清中TNF-α、NF-κB和ICAM-1濃度顯著降低(P＜0.

16、05和P＜0.01)，苦苣提取物1.6g/kg均使血清TNF-α、NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05)。
　　 5.力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1含量的動態(tài)變化及苦苣提取物的干預(yù)作用——ELISA法
　　 (1)與安靜對照組比較，反復(fù)力竭性運動后3h、24h和48h組大鼠心肌組織中TNF-α含量均顯著升高(P＜0.05)，運動后即刻、6h、12h和96h有升高趨勢，3h和48h

17、分別達高峰，呈雙峰變化;力竭性運動后3h、6h、12h、24h、48h和96h組大鼠心肌組織中NF-κκB含量均明顯升高（P＜0.05和P＜0.01），3h和48h分別達高峰，呈雙峰變化;運動后即刻、3h、6h、12h和24h組大鼠心肌組織中ICAM-1含量均顯著升高(P＜0.05)，3h達高峰，隨后逐漸降低。
　　 (2)與力竭性運動后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κB和IC

18、AM-1濃度均顯著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg使大鼠心肌組織NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05);與運動后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組均使大鼠心肌組織中TNF-α和NF-κB顯著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg均使心肌組織中TNF-α、NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05)。
　　 6.力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1蛋白的表達及苦苣

19、提取物的干預(yù)作用——免疫組織化學(xué)法
　　 (1)與安靜對照組比較，力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κ B和ICAM-1蛋白表達均有增多，其中運動后48h TNF-α蛋白表達最多，運動后3h NF-κ B蛋白表達最多，運動后即刻ICAM-1蛋白表達最多。
　　 (2)與力竭性運動后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組大鼠心肌組織中TNF-α蛋白表達有所減少，NF-κB和ICAM-1蛋白表達

20、顯著減少;與運動后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κB和ICAM-1蛋白表達均明顯減輕，苦苣提取物1.6g/kg使NF-κB和ICAM-1蛋白表達均明顯減輕。
　　 7.力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α和ICAM-1蛋白表達及苦苣提取物的干預(yù)作用—Western-blotting法
　　 (1)Western-blotting實驗結(jié)果顯示，與安靜對

21、照組比較，力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κB和ICAM-1蛋白表達均顯著升高，其中TNF-α蛋白表達以運動后48h組為最高，NF-κB表達以運動后即刻、12h和48h分別達高峰，ICAM-1蛋白表達以運動后24h達高峰。
　　 (2)與力竭性運動后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg給藥24h組均使大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κκB和ICAM-1蛋白表達有所減少;與力竭性運動后48h組

22、比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組大鼠心肌組織中TNF-α和NF-κB蛋白表達降低更為明顯。
　　 8.力竭性運動后不同時相心肌組織中TNF-αmRNA、NF-κBmRNA和ICAM-1mRNA的表達及苦苣提取物的干預(yù)作用——qRT-PCR法
　　 (1)qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，與安靜對照組比較，反復(fù)力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織中TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1mRNA水平均顯著升

23、高(P＜0.05和P＜0.01)，其中運動后48h達高峰。
　　 (2)與力竭性運動后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組使大鼠心肌組織中TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1 mRNA表達水平均顯著降低，苦苣提取物1.6g/kg使TNF-α mRNA明顯降低，NF-κB mRNA和ICAM-1mRNA表達水平有所下降。與力竭性運動后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組大鼠心肌組織中

24、TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1 mRNA表達水平明顯下降(P＜0.05和P＜0.01)。
　　 9.力竭性運動后不同時相大鼠心肌細胞凋亡的動態(tài)變化及苦苣提取物的干預(yù)作用——TUNEL法和Hoechst33325染色法
　　 (1)TUNEL法結(jié)果顯示，安靜對照組大鼠心肌組織存在少數(shù)散在的細胞凋亡;反復(fù)力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織均出現(xiàn)大量細胞凋亡，心肌細胞凋亡指數(shù)均明顯增加(P＜0.01)，

25、48h達高峰，且具有一定的時間依賴性特點。
　　 (2)Hoechst33325染色實驗結(jié)果顯示，安靜對照組大鼠灌流后的懸浮心肌細胞核多較完整，反復(fù)力竭性運動后24h和48h組均觀察到大量的核斷裂、濃染、固縮、核質(zhì)不均勻等細胞凋亡的形態(tài);與運動后24h和48h組相比，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg均明顯改善細胞凋亡狀態(tài)，凋亡細胞數(shù)目均有減少，3.2g/kg作用更為明顯。
　　 結(jié)論
　　 1.1周反復(fù)力

26、竭性運動可以成功地建立延遲性心肌損傷模型。
　　 2.大鼠心肌酶譜和心肌組織結(jié)構(gòu)改變均證實，反復(fù)力竭性運動可以引起運動后恢復(fù)期不同時間點大鼠心肌組織不同程度的損傷?？嘬奶崛∥?.2g/kg和1.6g/kg可以改善力竭性運動誘發(fā)的心肌超微結(jié)構(gòu)損傷和形態(tài)學(xué)改變。
　　 3.ELISA法、免疫組化法以及Western-blotting法均證實，反復(fù)力竭性運動可以引起運動后恢復(fù)期不同時間點大鼠血清和心肌組織中TNF-α、NF-κ

27、 B和ICAM-1蛋白表達不同程度的升高，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以降低TNF-α、NF-κ B和ICAM-1蛋白表達水平。
　　 4.qRT-PCR法證實，反復(fù)力竭性運動后不同時相心肌組織中TNF-α mRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA表達均有不同程度的升高，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以明顯降低TNF-α mRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA表達水平。

28、　　 5.TUNEL法和Hoechst33325染色法均證實，反復(fù)力竭性運動后不同時相大鼠心肌組織均出現(xiàn)大量細胞凋亡，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg均明顯減少心肌細胞凋亡。
　　 6.不同方法進一步證實了炎癥介質(zhì)NF-κB、TNF-α、ICAM-1和心肌細胞凋亡在力竭性運動誘發(fā)延遲性心肌損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　 7.苦苣提取物對力竭性運動所致的延遲性心肌損傷具有保護作用，其機制可能與降低心肌組織中