1、目的：腎癌是泌尿道最常見的惡性腫瘤之一,其向周圍以及遠隔器官侵襲轉移是腎癌患者死亡的主要原因,目前腎癌向區(qū)域及臟器轉移機制仍然不明。對腎癌轉移機制的深層認識,從基因/分子水平找突破口是解決問題的一條途徑。PRL屬于一類新的PTP,PRL-3是PRL家族的一個成員。文獻報道,PRL-3高表達與多種腫瘤的轉移相關。而PRL-3高表達在腎癌領域尚無相關性報道。本課題的目的在于,構建攜帶有PRL-3特異miRNA的慢病毒載體,在腎癌細胞株上觀察

2、其沉默腎癌PRL-3基因后對腎癌細胞侵襲力與遷移力的影響,以此評價PRL-3基因在腎癌轉移中的作用,從而為腎癌轉移的后續(xù)治療打下基礎。 方法：利用Invitrogen公司miRNA網(wǎng)上設計工具,設計并合成3條PRL-3特異pre-miRNA-A,-B,-C;分別構建pcDNA.rPRL-3-miR-A,-B,-C表達質粒并轉染人腎癌786-O細胞,RT-PCR和Western Blot檢測沉默PRL-3基因效果；選擇pcDNA.

3、rPRL-3-miR-C質粒,經標準BP反應和標準LR反應構建重組質粒pLenti6/V5.rPRL-3miR-C,-neg(空載體);然后該重組質粒與包裝質粒ViraPowerTMPackaging Mix按比例共轉染293FT細胞包裝重組慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C,-neg(空載體)。以10倍為梯度用重組慢病毒感染786-O細胞,流式細胞儀檢測病毒滴度。Blasticidin篩選感染重組慢病毒的786-0細胞,牙科探針

4、在熒光顯微鏡下挑選熒光強度最高的細胞克??；RT-PCR和Western Blot法檢測沉默PRL-3基因效果。 將細胞分成3組：786-O(對照)組,Lenti.rPRL3-miR-C組和Lenti.rPRL3-miR-neg(空載體)組,每組8個復孔,分別培養(yǎng)于12孔板中,當細胞生長到融合度為95％時,以1 mL槍頭作劃痕試驗,24小時后計算各組遷移到劃痕區(qū)域的細胞數(shù)。將各組細胞在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,各組

5、細胞在Transwell板上各取6個復孔,下室中加入完整培養(yǎng)基500μL,上室中加入含有1×105個細胞的無血清培養(yǎng)基100μL,24小時后用棉簽去掉隔膜上表面的細胞,然后固定、復染,在100倍顯微鏡下挑5個不同視野計數(shù)隔膜下表面的細胞,計算細胞侵襲力。 結果：將pre-miRNA-A,-B,-C連接到表達質粒上即可得到重組質粒pcDNA.rPRL3-miR-A,-B,-C,測序表明,3個重組質粒的堿基序列均正確；RT-PCR和

6、Western Blot結果顯示pcDNA.rPRL3-miR-C質粒的沉默效果最顯著。該質粒和空載體質粒進一步經BP和LR反應重組得到質粒pLenti6/V5.rPRL3-miR-C,-neg,測序表明,兩個質粒的堿基序列都正確。將病毒上清加入786-O細胞后12小時后即可觀察到綠色熒光產生證明慢病毒被成功包裝；流式細胞儀檢測得到濃縮后的重組慢病毒Lenti.rPRL3-miR-C滴度為2×106 TU/mL,空載體重組慢病毒Lent

7、i.rPRL3-miR-neg的滴度為2.5×106 TU/mL。侵襲實驗結果顯示,侵過基質膠膜的細胞均數(shù)為：786-O組為109±23/HP;Lenti.rPRL3-miR-neg組為112±15/HP;Lenti.rPRL3-miR-C組為32±10/HP。統(tǒng)計分析表明：Lenti.rPRL3-miR-C組侵過基質膠膜細胞數(shù)明顯少于其他兩組(P＜0.05)。遷移力實驗表明：786-O組的平均遷移能力為23±2.6 cells/mm2

8、;Lenti.rPRL3-miR-neg組為20.8±1.9 cells/mm2;Lenti.rPRL3-miR-C組為5±1.6 cells/mm2。統(tǒng)計分析表明：相同面積下Lenti.rPRL3-miR-C組遷移到劃痕中的細胞數(shù)明顯少于其他兩組(P<0.05)。 結論：人工設計的microRNA對目標基因具有更好的沉默效率,可滿足基因功能的研究：重組慢病毒載體可為長時間的動物體內實驗提供一個很好的解決方案；沉默PRL-3基因