1、本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌Fus3/Kss1MAPK級聯(lián)途徑下游的核心轉(zhuǎn)錄因子StSte12調(diào)控病菌附著胞發(fā)育及侵染過程，它直接結(jié)合于StCHS5的啟動子區(qū)域調(diào)控其表達(dá)。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定了大斑病菌中幾丁質(zhì)合酶基因家族，并利用Real-time PCR技術(shù)分析了幾丁質(zhì)合酶基因家族在病菌各個(gè)生長時(shí)期的表達(dá)模式。利用基因敲除技術(shù)獲得了StCHS5基因敲除突變體，通過對突變體的分析，明確了該基因部分生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如

2、下:
　　1.在大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出了幾丁質(zhì)合酶基因家族并分析了其結(jié)構(gòu)特征。該家族包含8個(gè)幾丁質(zhì)合酶基因（StCHS1-StCHS8），基因組定位顯示該家族成員分散在病菌基因組中，其中StCHS4，StCHS5，StCHS2位于scaffold18上并串聯(lián)排列。這8個(gè)幾丁質(zhì)合酶基因可分為7類，存在于3個(gè)亞家族中，其中StCHS6(classⅢ)，StCHS7(classⅠ)，StCHS8(classⅡ)屬于亞家族Ⅰ，包含催

3、化結(jié)構(gòu)域Ⅰ和多次跨膜結(jié)構(gòu)域;StCHS1(classⅣ)，StCHS2(classⅥ)，StCHS5(classⅤ)屬于亞家族Ⅱ，包含催化結(jié)構(gòu)域Ⅱ和細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域，其中幾丁質(zhì)合酶第Ⅴ類和第Ⅵ類還包含肌動蛋白結(jié)構(gòu)域;StCHS3和StCHS4屬于第Ⅶ類，且屬于亞家族Ⅲ，這類幾丁質(zhì)合酶基因只包含跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　2.獲得了4株StCHS5基因敲除突變體。以pPZP100載體為基本骨架、潮霉素抗性基因(HPH)作為篩選標(biāo)記，成功構(gòu)建

4、了StCHS5基因敲除載體;利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)化大斑病菌野生型菌株01-23，通過潮霉素抗性篩選、特異引物PCR、RT-PCR驗(yàn)證，獲得了4株StCHS5基因敲除突變體，分別命名為△StCHS5-1,△StCHS5-2,△StCHS5-3,△StCHS5-4。
　　3.研究發(fā)現(xiàn)StCHS5基因參與調(diào)控病菌的生長發(fā)育。與野生型菌株相比，突變體△StCHS5-1，△StCHS5-2，△StCHS5-3，△StCHS5-4的菌

5、落顏色形態(tài)、菌絲形態(tài)、分生孢子產(chǎn)量均發(fā)生顯著變化。突變體菌落顏色變淺，且產(chǎn)生較多的疏松的氣生菌絲;光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體菌絲細(xì)胞較野生型變長，但菌絲細(xì)胞直徑?jīng)]有明顯差異;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，突變體菌落生長速率增大，不產(chǎn)生分生孢子，黑色素含量顯著下降。
　　4.闡明了StCHS5基因參與調(diào)控大斑病菌細(xì)胞壁發(fā)育。①在CFW和剛果紅等細(xì)胞壁合成干擾物質(zhì)的處理?xiàng)l件下，突變體菌落生長受抑制程度顯著低于野生型，表明StCHS5基因的缺失提高了

6、病菌對細(xì)胞壁合成干擾物質(zhì)的耐受性。②通過掃描電鏡觀察突變體菌絲細(xì)胞壁的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StCHS5基因的敲除突變體較野生型菌株細(xì)胞壁明顯變薄，細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的褶皺，胞吐現(xiàn)象明顯。③在細(xì)胞壁降解酶的作用下，StCHS5基因的敲除突變體產(chǎn)生的原生質(zhì)體是野生型的2.81倍。④對突變體細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量分析發(fā)現(xiàn)，野生型菌株中幾丁質(zhì)含量是StCHS5基因的敲除突變體中的21倍。以上結(jié)果表明，StCHS5基因不僅影響了病菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，也影響了

7、細(xì)胞壁的組分。
　　5.闡釋了StCHS5基因參與大斑病菌的附著胞發(fā)育及侵染過程，但對病菌的致病毒素的毒力沒有影響。①對突變體菌絲產(chǎn)生附著胞的情況分析發(fā)現(xiàn)StCHS5基因敲除突變體不能形成正常的附著胞和侵入釘結(jié)構(gòu)。②玻璃紙穿透試驗(yàn)進(jìn)一步表明野生型菌絲可穿透玻璃紙，而突變體的菌絲不能穿透玻璃紙。③對病菌致病毒素的活性分析發(fā)現(xiàn)，其粗毒素活性與野生型的相比沒有明顯變化。④對致病性進(jìn)行分析表明，StCHS5基因敲除突變菌株不能侵染健康的玉

8、米葉片，但能夠侵入并定殖在刺傷的寄主中。
　　6.明確了大斑病菌幾丁質(zhì)合酶基因家族在野生型菌株及突變體中的表達(dá)模式。①利用Real-time PCR技術(shù)檢測了幾丁質(zhì)合酶基因在病菌菌絲、分生孢子、芽管萌發(fā)、附著胞和侵入絲等時(shí)期的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，StCHS1，StCHS3，StCHS4在菌絲時(shí)期相對表達(dá)水平最高，其次為附著胞時(shí)期，表達(dá)水平最低的為芽管萌發(fā)時(shí)期;StCHS6在菌絲時(shí)期相對表達(dá)水平最低，其他時(shí)期均顯著上升，且在芽管時(shí)期

9、最高;StCHS2，StCHS5，StCHS7，StCHS8均在附著胞時(shí)期相對表達(dá)水平最高，且相對菌絲時(shí)期，侵入絲時(shí)期StCHS2,StCHS5均顯著下降，StCHS7變化不大，StCHS8顯著上升。②分析了病菌中幾丁質(zhì)合酶基因在StCHS5基因敲除突變體中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，除了StCHS3基因，其余幾丁質(zhì)合酶基因表達(dá)量均有所升高，其中StCHS1基因在StCHS5基因敲除突變體中表達(dá)量提高了1287.22倍，StCHS2提高了30