1、 目的：研究鏈脲佐菌素(streptozotocin ,STZ)誘導的糖尿病胃輕癱大鼠(disbetic gastroparesis , DGP)胃平滑肌細胞大電導鈣激活鉀通道( large conductance calcium-activated potassium channels, BKCa)的變化,探討糖尿病胃輕癱的病理機制與胃平滑肌細胞 BKCa通道的關(guān)系,為探索新的藥物和治療方法提供實驗依據(jù)。
方法：1.動

2、物分組及造模：健康純系雄性SD大鼠50只,隨機分為對照組和模型組。模型組用0.1mmol/L檸檬酸緩沖液配制的2% STZ 60mg/Kg一次性腹腔內(nèi)注射,3日后禁食不禁水6h,采尾血測空腹血糖,以血糖持續(xù)一周≥16.9mmol/L為糖尿病造模成功；對照組用0.1mmol/L檸檬酸緩沖液2ml/Kg一次性腹腔內(nèi)注射,兩組均給予標準鼠飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。10周后測量大鼠空腹血糖及體重,將1 mg/ml美藍溶液0.4ml灌胃,30min后處死大鼠

3、,將胃內(nèi)殘留物用4ml生理鹽水沖洗并收集沖洗液,離心取上清液,用722分光光度計在640nm波長檢測吸光度值(OD),測量胃內(nèi)色素殘留率。血糖≥16.9mmol/L伴胃排空速率顯著下降表明 DGP 造模成功。2.急性酶分離 SD 大鼠胃平滑肌細胞：將大鼠禁食不禁水24h后處死,開腹取胃,剪開胃部,用無鈣生理溶液漂洗干凈,體式顯微鏡下剝下肌層,沿肌條方向剪成1mm×3 mm的組織條塊,置于低鈣生理溶液中保存20分鐘后放入木瓜蛋白酶酶液,于

4、37℃恒溫水浴箱中振蕩消化15min,在顯微鏡下找到10個左右細胞/低倍視野(10×10),且細胞膜完整光滑,折光性好,即可終止酶解,置于 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.單通道膜片鉗技術(shù)記錄大鼠胃平滑肌細胞 BKCa通道電流：選擇貼壁良好、胞膜完整和折光性好的細胞進行實驗。操縱微推進器使電極尖端貼附在細胞表面,采用細胞貼附式膜片(cell-attached patch)和內(nèi)面向外式膜片(inside-out patch)記錄BKCa電流。采樣

5、頻率為10 kHz,方式為Gap Free,時間為30秒。記錄數(shù)據(jù)由pClamp 6.0軟件儲存,用Clampfit 10.1軟件分析,Origin8.0軟件進行直線擬合與繪圖。4.免疫組織化學技術(shù)測定 BKCa通道蛋白 KCNMA和 KCNMB1 的表達：將胃組織固定、脫水、透明、包埋,用 Leica2245 切片機進行切片。按抗體說明書操作步驟進行免疫組織化學檢測。采用OLYMPUS 1X71光學照相系統(tǒng)拍照,Image-Pro-P

6、lus6.0軟件進行圖形數(shù)據(jù)分析。
結(jié)果：1.模型組大鼠體重(190±23.71 g)明顯低于對照組(428±25.05 g), P<0.01。模型組大鼠平均血糖濃度(30.26±2.19mmol/L)顯著高于對照組(4.83±1.09 mmol/L),P<0.01。胃內(nèi)色素殘留率反映了胃排空情況,模型組大鼠胃內(nèi)色素殘留率(54.50%±3.92%)明顯高于對照組(4 0.69%±3.55 %),P<0.01。以上結(jié)果提示

7、大鼠DGP造模成功 2. 急性酶分離的SD大鼠胃平滑肌細胞多呈梭形,細胞核規(guī)則,細胞膜完整,折光性強,數(shù)量多,能滿足膜片鉗實驗需要。 3. SD大鼠胃平滑肌細胞BKCa通道單通道電流鑒定及特性：①在內(nèi)面向外式膜片下,膜電位(Vm)為+30 mV,于浴液中加入200 nmol/L BKCa通道特異性阻斷劑 IbTX,膜片單通道電流被阻斷。②膜片單通道電流電導值為211.7±13.6 pS,具有大電導的特性。③膜片單通道電流圖形具有明顯的電

8、壓依賴性和細胞胞漿面鈣離子濃度依賴性,浴液中游離Ca2+濃度分別為0,10-7,5×10-7,10-6 nM時, 開放概率(Open Probability,NPO)分別為0.018±0.007,0.0482±0.013,0.156±0. 017,0.506±0.019。綜合以上實驗結(jié)果,所記錄的單通道電流符合BKCa通道特性,為BKCa通道單通道電流 4. 對照組大鼠胃平滑肌BKCa通道單通道電流與模型組對比：在細胞貼附式膜片下(Vm

9、=+40mV),對照組BKCa通道N PO為0.018±0.006、電流幅值(amplitude of current,Amp)為7.9298±0.77 8 pA、平均開放時間(the mean open time,TO)為17.642±5.651 ms、平均關(guān)閉時間(the mean close time,TC)為578.857±203.829 ms；模型組BK Ca通道開放概率為0.058±0.014、電流幅值為8.641±0.67

10、3、平均開放時間為4. 814±2.639、平均關(guān)閉時間為276.785±116.530。與對照組比較,模型組大鼠胃平滑肌細胞BKCa通道開放概率顯著上升(t=9.294,P<0.01),電流幅值增加(t=2.592,P=0.015),通道平均開放時間減少(t=7.965,P<0.01),平均關(guān)閉時間減少(t=4.814,P<0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。 5. 免疫組織化學技術(shù)檢測KCNMA蛋白與KCNMB1蛋白表達：對照組KCNM

11、A蛋白表達光密度值(Inte grated Optical Density,IOD)為13558.2±2216.5,KCNMB1蛋白表達IOD值為525875.5±65718.1；模型組KCNMA蛋白表達IOD值為29801.6±3123.1,K CNMB1蛋白表達IOD值為493504.6±27916.2。與對照組比較,模型組SD大鼠胃平滑肌細胞BKCa通道KCNMB1蛋白表達增加(t=9.484,P<0.01),差異具有統(tǒng)計學意義；

12、KCNMA蛋白表達無明顯變化(t=1.014,P=0.334),差異不具有統(tǒng)計學意義。
結(jié)論：1.膜片鉗實驗記錄的胃平滑肌細胞單通道電流為 BKCa通道單通道電流,具有大電導、電壓依賴性、鈣離子濃度依賴性等特性。2.在細胞貼 附式膜片上,DGP大鼠胃平滑肌細胞BKCa通道單通道電流開放概率增加,開放幅度上升,功能活動增強,DGP發(fā)病與BKCa通道功能活動增強相關(guān)。3.DGP大鼠胃平滑肌細胞BKCa通道KCNMB1蛋白表達上