1、樟芝(Antrodia camphorata)是新近發(fā)現(xiàn)的一種食藥用真菌,因?yàn)槠渥訉?shí)體具有的生物活性作用,引起廣泛的關(guān)注；出于對(duì)保護(hù)環(huán)境、自然資源匱乏和子實(shí)體栽培技術(shù)尚未成功等因素的考慮,近年來(lái),樟芝菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)的研究進(jìn)展迅速。多糖是樟芝中主要的生物活性因子,對(duì)樟芝深層發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品研究和開(kāi)發(fā)有著重要的意義。本文研究?jī)?nèi)容包括樟芝深層發(fā)酵生物學(xué)特性、樟芝多糖和菌絲體產(chǎn)量為指標(biāo)的最佳培養(yǎng)基配方的篩選、樟芝發(fā)酵工藝、樟芝菌絲體多糖提取

2、工藝、樟芝深層發(fā)酵菌絲體營(yíng)養(yǎng)成分分析,以及樟芝菌絲體多糖的理化特性、功能學(xué)特性等品質(zhì)學(xué)性質(zhì)的研究,并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出樟芝菌絲體多糖口服液。主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴樟芝菌株鑒定rDNA序列分析。樟芝菌株rDNA的ITS序列在NCBI上BLAST,進(jìn)行同源性比對(duì)達(dá)99％以上,可判斷所用菌株確實(shí)為樟芝菌株Antrodia camphorata。
　　 ⑵樟芝菌絲體深層發(fā)酵生物學(xué)特性的研究。十五種碳源對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用天

3、然多糖類物質(zhì)(米粉、面粉、玉米粉、甘薯粉、木薯粉)為培養(yǎng)基碳源,其樟芝菌絲體產(chǎn)量,明顯高于雙糖和單糖(麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖),也高于化學(xué)制劑多糖(可溶性淀粉、微晶纖維素)。三類氮源,對(duì)樟芝菌絲體產(chǎn)量的影響結(jié)果顯示:有機(jī)氮高于銨態(tài)氮,銨態(tài)氮高于硝態(tài)氮。即有機(jī)氮(黃豆粉>玉米粉>蛋白胨)>銨態(tài)氮(酒石酸銨>氯化銨>磷酸氫二銨>硫酸銨)>硝態(tài)氮,樟芝不能利用硝態(tài)氮。樟芝菌絲生長(zhǎng)最適合的碳氮比(C／N)為5

4、0:1～100:1；常量元素鈉離子和鎂離子對(duì)樟芝菌絲生長(zhǎng)并不是必需的；鈣、硫、磷、鉀離子是樟芝菌絲生長(zhǎng)所必需的,缺乏鉀離子將顯著地影響菌絲生長(zhǎng)。微量元素Co對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用；分別添加6種維生素(生物素、核黃素、硫胺素、尼克酸、葉酸、抗壞血酸)對(duì)樟芝菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響；樟芝菌絲適于酸性和中性條件下生長(zhǎng),pH4～8之間菌絲生長(zhǎng)速度差異不顯著,都生長(zhǎng)較好；pH9以上菌絲不能生長(zhǎng)；光照與黑暗下樟芝菌絲的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異。
　　 ⑶

5、樟芝菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究。以樟芝菌絲體含量和樟芝多糖含量作為指標(biāo),采用L27(313)五因素三水平的正交設(shè)計(jì),確定樟芝菌的深層發(fā)酵最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20％+(黃豆粉O.5％+玉米粉O.5％)+(酵母膏0.15％+蛋白胨0.15％)+麩皮0.2％+(KH2PO40.05％+MgSO40.035％)。以樟芝菌絲體含量和樟芝多糖含量作為指標(biāo),采用U12(1212)三因素四水平的均勻設(shè)計(jì),確定最佳的發(fā)酵參數(shù):接

6、種量為15％(V／V),種子菌齡為8d,培養(yǎng)溫度為26℃。同時(shí)獲得樟芝菌絲體干重為11克／升發(fā)酵液。通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,掌握了樟芝發(fā)酵過(guò)程各項(xiàng)指標(biāo)的變化規(guī)律:發(fā)酵4天以后,菌絲開(kāi)始快速生長(zhǎng),氨態(tài)氮水平降低。在發(fā)酵后的第16天,菌絲生長(zhǎng)到達(dá)了穩(wěn)定期,之后有些老菌絲開(kāi)始自溶,使氨態(tài)氮又有所回升。這一轉(zhuǎn)折點(diǎn)作為菌絲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期的標(biāo)志。
　　 ⑷樟芝多糖提取工藝研究。樟芝菌絲體中粗脂肪含量為11.61％(m／m),其中飽和脂肪酸

7、占12.6％(v／v),不飽和脂肪酸占87.4％(v／v)；樟芝菌絲體中粗蛋白含量為34.20％(m／m),總氨基酸含量為270.68mg／kg(m／m),達(dá)FAO標(biāo)準(zhǔn)的26.6倍,含有人體所需的8種必需氨基酸；樟芝菌絲體含常量元素K、Na、P、Ca、Mg和多種人體所需的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu、Mo、Cr、Se、sr等；樟芝菌絲體中麥角甾醇的含量為19.55mg／g(m／m),總?cè)频暮繛?.81mg／g(m／m)。樟芝菌絲浸

8、提的次數(shù)為2次時(shí),可提取其中多糖的94％；利用超低溫冷凍方法處理(凍融破壁作用)對(duì)樟芝多糖的提取具有很好的效果,其它方法處理的效果(超聲波處理、液氮處理、冷凍干燥處理等)都比對(duì)照菌絲干燥法有不同程度的提高。利用響應(yīng)面法優(yōu)化樟芝多糖提取工藝和條件。建立了樟芝多糖提取方法的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型,驗(yàn)證了模型的有效性,并探討了溫度、時(shí)間、水料比三個(gè)因子的交互作用及其最佳水平范圍,優(yōu)化出樟芝多糖提取的外界條件為:溫度120℃,時(shí)間110.4min,水

9、料比1:1.89。
　　 ⑸樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖性質(zhì)的研究。對(duì)樟芝菌絲體提取液、樟芝發(fā)酵液在不同乙醇濃度下沉淀得到的多糖的理化性質(zhì)、紅外光譜和凝膠色譜特征等進(jìn)行研究,結(jié)果顯示:樟芝菌絲體多糖為棕褐色蓬松粉末,質(zhì)輕,無(wú)特殊氣味,易溶于水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑,其比旋光度為48.31；樟芝菌絲體多糖與苯酚-硫酸試劑反應(yīng)呈紅色,與蒽酮試劑反應(yīng)呈藍(lán)綠色,與間苯二酚試劑反應(yīng)呈紫紅色,與KI-I2不顯色。紅外光譜測(cè)定表明,不同

10、乙醇濃度梯度沉淀的樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖具有多糖的特征吸收,并且其糖環(huán)為吡喃環(huán)。分步沉淀的樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖經(jīng)高效液相色譜GPC柱分離各得到3～4個(gè)峰,計(jì)算得各組分的數(shù)均分子量和重均分子量。不同濃度乙醇沉淀處理對(duì)樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖分子量的影響表現(xiàn)在低濃度(65％)乙醇沉淀出較大分子量的多糖組分,而高濃度(75％、85％)乙醇沉淀出較小分子量的多糖組分。較高濃度乙醇沉淀的多糖,不管是樟芝發(fā)酵液多糖還是樟芝菌絲體多糖,體外試驗(yàn)表明都

11、具有較高的清除超氧自由基的活性。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2的多糖含量分別為31.76％和38.09％,樟芝菌絲體多糖、發(fā)酵液多糖的提取率分別為1.59％和4.89％。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2的特性粘度[η]為1.982和1.657。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2經(jīng)高效液相色譜GPC柱分離后,各得到三個(gè)峰,高效液相色譜測(cè)定證明樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖中已完全除去蛋白質(zhì)和小分子還原糖,

12、因此,凝膠色譜圖之間的色譜峰為大分子多糖。采用GPC軟件計(jì)算樣品各組分的數(shù)均分子量和重均分子量。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2為灰白色疏松纖維狀粉末,紅外光譜圖及譜峰歸屬分析得出兩種多糖樣品均具有多個(gè)多糖特征吸收峰。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2的濃度達(dá)3g／L時(shí),超氧自由基的清除率分別達(dá)到74.8％和76.9％。ACP1和ACP2經(jīng)凝膠葡聚糖sephadexG-200柱層析分別洗脫出的精多糖單一主峰AC

13、P1-1和ACP2-1,其超氧自由基的清除率分別達(dá)到54.7％和61.6％,說(shuō)明樟芝菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力。
　　 ⑹樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖生物活性的研究。樟芝菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖對(duì)小鼠宮頸癌U14有顯著抑制作用,其腫瘤抑制率分別為44.7％和77.2％,樟芝發(fā)酵液多糖的抑制率顯著高于樟芝菌絲體多糖的抑制率。選擇樟芝菌絲體多糖(胞內(nèi)ACP1)和樟芝發(fā)酵液多糖(胞外ACP2)的低、中、高劑量組,分別為10

14、0、400、1600mg／kgBW三個(gè)劑量,連續(xù)灌胃30天,進(jìn)行小鼠免疫功能試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明樟芝菌絲體多糖和樟芝發(fā)酵液多糖(ACP1、ACP2)對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個(gè)方面均有增強(qiáng)作用,且有劑量效應(yīng)關(guān)系；樟芝發(fā)酵液多糖這四個(gè)方面的免疫功能都高于樟芝菌絲體多糖。
　　 ⑺樟芝多糖口服液的研制。以感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)作為評(píng)定指標(biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化樟芝發(fā)酵多糖口服液的制備工藝?？诜褐刑砑踊旌咸?/p>