1、第一部分P-糖蛋白與類風濕關節(jié)炎多藥耐藥及TNF-α水平的相關性研究。
　　 目的：檢測正常對照組、RA初發(fā)未治組、RA治療有效組、RA難治組患者外周血單個核細胞P-gp表達和功能、TNF-α mRNA，血清TNF-α水平，分析P-gp與RA多藥耐藥及TNF-α相關性，探討P-gp、TNF-α在RA多藥耐藥中的作用及其相關性。
　　 方法：入選RA初治組、治療有效組、難治組患者和正常對照組各20例為研究對象。RA初治組未

2、經(jīng)任何DMARDs及生物制劑治療。RA治療有效組和難治組以聯(lián)合甲氨蝶呤、來氟米特為基礎治療藥物，未經(jīng)糖皮質激素和生物制劑治療。入組RA患者進行疾病活動度評分(DAS28)。采集入組患者血標本進行血清和外周血單個核細胞的分離。以流式細胞儀檢測外周血單個核細胞的P-gp的表達，羅丹明123蓄積試驗檢測外周血單個核細胞的P-gp的功能，RT-PCR檢測外周血單個核細胞TNF-α mRNA水平，ELISA檢測血清TNF-α濃度。
　　

3、結果：
　　 1.外周血單個核細胞P-gp的表達和功能：在正常對照組有P-gp表達，但表達量和功能低；RA初治組、RA治療有效組及RA難治組P-gp表達和功能均高于正常對照；RA難治組P-gp的表達和功能較RA初治組、RA治療有效組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；RA初治組P-gp的表達和功能高于RA治療有效組(P<0.05)。
　　 2.外周血單個核細胞TNF-α mRNA和血清TNF-α水平：正常對照組T

4、NF-α mRNA表達水平明顯低于RA各組(P<0.01)。RA各組TNF-α mRNA表達水平兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，其中RA難治組TNF-α mRNA表達水平最高，RA治療有效組TNF-α mRNA表達水平最低。RA各組血清TNF-α含量較正常對照組高(P<0.01)，其中RA難治組明顯高于RA初治組和RA治療有效組(P<0.01)，RA初治組高于RA治療有效組(P<0.01)。
　　 3.RA各組疾病活

5、動的比較：RA初治組DAS28評分為5.70±1.46，明顯高于RA治療有效組(3.78±0.79，P<0.01)；RA難治組DAS28評分為7.02±0.93，明顯高于其它兩組(P<0.01)。
　　 4.PBMC P-gp的表達和功能與TNF-α mRNA、血清TNF-α水平和疾病活動度的相關性分析：PBMC P-gP的表達與PBMC TNF-αmRNA水平、血清TNF-α的水平均呈正相關(r=0.29，P<0.01；r=0

6、.758，P<0.01)；羅丹明蓄積細胞內熒光強度與PBMC TNF-αmRNA、血清TNF-α的水平呈負相關(r=-0.843，P<0.01；r=-0.863，P<0.01)。PBMC P-gp的表達與DAS28做相關性分析，顯示二者呈正相關(r=0.588，P<0.01)，羅丹明蓄積細胞內熒光強度與DAS28做相關性分析，顯示二者呈負相關(r=-0.702，P<0.01)。
　　 5.PBMC P-gP的表達和功能與病程和用

7、藥時間的相關性分析：P-gp表達和功能與RA的病程和用藥時間無明顯關聯(lián)。
　　 結論：
　　 1.RA難治組的PBMC P-gp表達和功能明顯高于與RA初治組和RA治療有效組，P-gp表達升高功能增強與RA的難治程度有關，P-gp參與難治性RA多藥耐藥的形成。
　　 2.RA治療有效組P-gp表達和功能較RA初治組下降，且RA各組P-gp表達和功能與疾病活動評分DAS28呈正相關，提示P-gp可作為RA治療效果的

8、監(jiān)測指標之一。
　　 3.P-gp表達和功能與RA的病程和用藥時間無明顯關聯(lián)。
　　 4.P-gp表達和功能與PBMC TNF-α mRNA、血清TNF-α呈正相關，TNF-α可能參與P-gp介導的RRA多藥耐藥的形成。
　　 5.P-gp的表達和活性受原發(fā)耐藥、繼發(fā)耐藥、疾病活動內環(huán)境改變等多重因素的影響。疾病活動內環(huán)境改變可能在RA P-gp的表達和活性增強中起著重要作用。
　　 第二部分 TNF-α

9、對RA外周血單個核細胞P-gp表達及活性的影響。
　　 目的：觀察TNF-α對RA外周血單個核細胞后P-gp表達及活性的影響，探討TNF-α在RA MDR形成中的作用。
　　 方法：入選RA初治組、治療有效組、難治組患者和正常對照組各20例為研究對象。采集入組患者血標本并進行外周血單個核細胞的分離，以終濃度0.5ng/ml的TNF-α作用于外周血單個核細胞，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)，分別在TNF-α干預前和

10、干預后2h、6h、12h、24h后，收集細胞，流式檢測PBMC P-gp的表達，羅丹明123蓄積試驗檢測PBMC P-gp功能。
　　 結果：在TNF-α預2h后，各組P-gp的表達與干預前無明顯變化，但Rh123蓄積試驗熒光強度下降，即P-gp的功能增強。干預12h各組的P-gp的表達和功能都能達到最大值并維持在高水平的平臺上。干預12h與干預24h P-gp的表達和功能差異無統(tǒng)計學意義。在6h和12h的P-gp的檢測中發(fā)現(xiàn)，

11、各組在起效時間和達峰時間上不一致。在正常對照組干預6h，P-gp的表達較干預前升高(P<0.05)，干預12h P-gp的表達達峰。在RA初治組，在干預6h，P-gp的表達較干預前升高(P<0.05)，干預12h P-gp的表達達峰。在RA治療有效組，干預12h，P-gp的表達才較干預前升高(P<0.01)并達到峰值。在RA難治組，干預6h P-gp的表達較干預前明顯升高(P<0.01)并達峰。干預12h P-gP的表達和功能達峰，比較

12、各組P-gp的表達和功能的情況，RA各組P-gp表達和功能高于正常對照組(P<0.01)；RA各組中難治組P-gP表達最高、功能最強，治療有效組P-gp表達最低、功能最弱。
　　 結論：
　　 1.TNF-α可增強RA患者的PBMC P-gp的表達和功能，介導RA的多藥耐藥，參與難治性類風濕關節(jié)炎的產(chǎn)生。
　　 2.RA各組PBMC對相同濃度的TNF-α刺激上調P-gp的速度和效率不同，難治組起效和達峰所需時間短

13、，治療有效組起效和達峰所需時間長，這種差異性可能與細胞自身對TNF-α的內在反應性有關。
　　 3.TNF-α對各組PBMC P-gp的表達和功能的影響，在作用12h均可達到最大值，此后維持在高水平的平臺上。
　　 4.RA P-gp表達和活性增高的機制復雜，TNF-α的作用僅為影響P-gp的表達和活性增高的機制之一。
　　 第三部分 TNF-α對RA外周血單個核細胞P-gP調控機制的研究。
　　 目的：

14、研究TNF-α信號轉導途徑中的MAPKs(ERK1/2、JNK和p38)及NF-κB信號轉導途徑在TNF-α增強RA PBMC P-gp表達和活性中的作用，探討TNF-α對RA PBMC P-gP的調控機制。
　　 方法：入選RA初治組患者20例，采集入組患者血標本并進行外周血單個核細胞的分離。每份標本設6組：A組、B組、C組、D組、E組和F組。A組為空白對照組。在C、D、E、F組分別加入NF-κB、JNK、ERK1/2、p38

15、的抑制劑PDTC、SP600125、U0126、SB202190進行預處理。處理30min后，B、C、D、E、F組均加入TNF-α，調整TNF-α終濃度為0.5ng/ml，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)，12h后收集細胞，流式檢測PBMC P-gP的表達，羅丹明蓄積試驗檢測PBMC P-gP功能。
　　 結果：與空白對照組相比，TNF-α組P-gp表達升高(P<0.01)，Rh123熒光強度降低(P<0.01)即P-g

16、p功能增強。用PDTC預處理抑制NF-κB活性或P600125預處理抑制JNK活性，與未預處理的TNF-α組相比，預處理組P-gp表達降低、功能減弱。用U0126預處理抑制ERK1/2活性或SB202190預處理抑制p38活性，與未預處理的TNF-α組相比，兩組P-gp表達和功能差異無統(tǒng)計學意義
　　 結論：
　　 1.NF-κB的抑制劑PDTC和JNK抑制劑SP600125均可下調TNF-α誘導的RA PBMC P-g

17、P的表達增加和功能增強。NF-κB和JNK信號轉導通路介導TNF-α對RA PBMC P-gP的表達和功能的調控。
　　 2.ERK1/2抑制劑U0126和p38-MAPK抑制劑SB202190對TNF-α誘導的RA PBMC P-gP的表達增加和功能增強無影響。ERK1/2通路和p38-MAPK信號通路不直接參與TNF-α對RA PBMC P-gp的表達和功能的調控。
　　 3.TNF-α通過NFκB和JN信號轉導通路