1、人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)由于自身所具有的多向分化潛能和無(wú)限增殖的能力使它擁有廣闊的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用前景。但是，人ES細(xì)胞建系過(guò)程中需要破壞受精卵或囊胚，因此，倫理問(wèn)題成為ES細(xì)胞研究無(wú)法逾越的障礙；此外，從ES細(xì)胞中獲得的功能細(xì)胞對(duì)患者來(lái)說(shuō)屬于異體細(xì)胞，細(xì)胞治療時(shí)的免疫排斥問(wèn)題嚴(yán)重阻礙了它的臨床研究進(jìn)展。在這種背景下，通過(guò)在分化的體細(xì)胞中表達(dá)特定的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，以誘導(dǎo)體細(xì)胞的重編程而獲得的可不斷自我更

2、新且具有多向分化潛能的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cell，iPSC)誕生了，由于它具有跟成體細(xì)胞完全相同的遺傳背景，又不涉及倫理道德問(wèn)題，因此在應(yīng)用潛能方面顯示出無(wú)比優(yōu)越性。但是，iPS細(xì)胞是否真正具備與ES細(xì)胞相同的分化能力和分化效率，是否能夠?yàn)閷?lái)的臨床移植提供具備相應(yīng)功能的供體材料，近年來(lái)一直是干細(xì)胞領(lǐng)域中所被高度關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 干細(xì)胞中的旁系群體(side population

3、，SP)也一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一。對(duì)于眾多干/祖細(xì)胞而言，一個(gè)非常顯著的共性就是跨膜蛋白ATP綁定結(jié)構(gòu)(ATP-Binding cassette，ABC)超家族成員之一，半轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCG2的表達(dá)。它們介導(dǎo)著包括細(xì)胞毒性藥物、類固醇、多肽、磷脂等在內(nèi)的多類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。ABCG2對(duì)熒光染料Hoechst33342的特異性排除，被認(rèn)為是干細(xì)胞中SP分選的分子基礎(chǔ)，因此被用做這類細(xì)胞的特異性標(biāo)記。然而ABCG2是否在人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中

4、表達(dá)?干細(xì)胞SP分選的“黃金法則”是否也同樣適用于這些細(xì)胞呢?
　　 帶著這些問(wèn)題，開始了我們的課題研究。整個(gè)課題是由三大研究部分所構(gòu)成：第一部分-“人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的建立”，第二部分-“人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的多項(xiàng)分化和第三部分-“剖析在人胚胎干細(xì)胞(hESCs)和誘導(dǎo)多能分化干細(xì)胞(iPSCs)中膜轉(zhuǎn)運(yùn)子ABCG2的表達(dá)與意義”。
　　 第一部分主要為iPS實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的建立。我們分別采用慢病毒

5、轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將不同的轉(zhuǎn)錄因子組合(Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4或Oct4，Sox2，Nonog，c-Myc，Klf4和Lin28)導(dǎo)入人胎肺成纖維細(xì)胞(IMR-90)中，成功將其誘導(dǎo)成為具有完全相同遺傳背景的iPS細(xì)胞株。經(jīng)相關(guān)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些iPS細(xì)胞均表達(dá)特異性多能分化標(biāo)記，且能在小鼠體內(nèi)形成包含三個(gè)胚層的畸胎瘤，提示它們具備跟ES細(xì)胞相似的多向分化潛能。
　　 第二部分主要為包括造血、神經(jīng)以及滋

6、養(yǎng)層細(xì)胞在內(nèi)的iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化。我們根據(jù)在人ES細(xì)胞的培養(yǎng)和分化的經(jīng)驗(yàn)，分別將我們所建立的iPS細(xì)胞系分化成造血細(xì)胞、神經(jīng)上皮細(xì)胞、各類終末神經(jīng)元以及滋養(yǎng)層細(xì)胞，并特別比較了人的ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的神經(jīng)分化效率。結(jié)果表明，我們所得到的iPS細(xì)胞均具備向上述各類細(xì)胞分化的能力，而且經(jīng)功能學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)將其誘導(dǎo)生成的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元被激發(fā)后可產(chǎn)生與ES細(xì)胞來(lái)源運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相似的動(dòng)作電位，提示這類神經(jīng)元是具備相關(guān)感觸和傳導(dǎo)功能的，有望用于將來(lái)的

7、臨床神經(jīng)退行性病變的治療，但是不同iPS細(xì)胞系在神經(jīng)分化的效率上存在著差異，其深層次的機(jī)制目前尚不可知。
　　 第三部分是一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向型課題。我們?cè)趯?duì)人ES細(xì)胞及iPS細(xì)胞的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常奇特的現(xiàn)象，那就是區(qū)別于其他類型的干/祖細(xì)胞，人的ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞胞核能夠被熒光染料hoechst所染色，通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明這種現(xiàn)象是由于干細(xì)胞SP的分選標(biāo)記-ABCG2在人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的缺失所導(dǎo)致的。并且恰恰相反，通過(guò)

8、常規(guī)方法hoechst染色對(duì)人ES細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選，得到拒染Hoechst的“SP”細(xì)胞實(shí)際上是多能分化基因已經(jīng)下調(diào)的分化細(xì)胞，證明經(jīng)典的干細(xì)胞“SP”的定義與分選并不適用于人的多能分化干細(xì)胞(ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞)。而有趣的是，來(lái)源于人ES細(xì)胞的滋養(yǎng)層細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞卻能夠表達(dá)ABCG2因而可以拒染hoechst。與之相對(duì)，我們?cè)谛∈蟮腅S細(xì)胞中檢測(cè)到ABCG2的表達(dá)以及對(duì)Hoechst的拒染，而在小鼠的滋養(yǎng)層細(xì)胞中卻未發(fā)現(xiàn)其表

9、達(dá)。在人ES細(xì)胞中強(qiáng)行表達(dá)ABCG2則可以顯著增強(qiáng)它們對(duì)熒光染料hoechst和化療藥物米托蒽醌(mitoxanthrone，MTX)的抵抗性，并且大部分人ES細(xì)胞在撤去生長(zhǎng)因bFGF(3天)后仍能維持其自我更新(self renew)狀態(tài)。我們?cè)诒磉_(dá)ABCG2的人ES細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)磷酸化的AKT表達(dá)水平顯著升高，提示ABCG2可能通過(guò)激活FGF信號(hào)通路的重要分支PI3K/AKT而降低人ES細(xì)胞對(duì)于子bFGF的依賴性，但是這其中的具體機(jī)制

10、還有待進(jìn)一步探討。
　　 綜上所述，我們成功地通過(guò)不同的病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了iPS技術(shù)平臺(tái)，并進(jìn)一步將所建立的iPS細(xì)胞系分化成造血干/祖細(xì)胞，神經(jīng)上皮細(xì)胞和區(qū)域神經(jīng)元，以及滋養(yǎng)層細(xì)胞，比較它們神經(jīng)分化能力的差異并進(jìn)行部分功能檢測(cè)，初步探討其做為不同細(xì)胞種類的移植候選物的可能性。同時(shí)我們首次系統(tǒng)性地闡述了干細(xì)胞SP分選標(biāo)記ABCG2在人多能分化干細(xì)胞(ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞)中的缺失，對(duì)于重新認(rèn)識(shí)干細(xì)胞中的旁系群體、ABCG2與干細(xì)