1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文桿狀病毒系統(tǒng)中地方株輪狀病毒蛋白的重組表達(dá)及病毒樣顆粒的構(gòu)建姓名：李國(guó)華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：錢(qián)淵2001.10.1中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文免疫原性，獲得抗輪狀病毒保護(hù)效果。通過(guò)自聚合過(guò)程，重組表達(dá)的VP2、VP6、VP7蛋白可以形成一穩(wěn)定的三層病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明這種病毒樣顆粒能夠提供抗輪狀病毒感染的保護(hù)。雖然輪狀病毒活疫苗的研究取得了很大進(jìn)展，但研究人員仍

2、在試圖找到一種更合適有效的疫苗。對(duì)重組輪狀病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)、功能及免疫學(xué)方面的大量研究使人們認(rèn)識(shí)到用重組表達(dá)方法獲得的病毒樣顆粒有可能作為亞單位疫苗獲得應(yīng)用。以重組病毒樣顆粒為疫苗具有諸多優(yōu)點(diǎn)：1可以構(gòu)建包含不同的GfliP血清型的重組病毒樣顆粒，2不需要使用可能影響抗原性的滅活試劑，3可以誘導(dǎo)針對(duì)更多種異型病毒的抗體，4非復(fù)制顆粒不可能發(fā)生病毒間的重組現(xiàn)象，使用安全。目前對(duì)輪狀病毒病毒樣顆粒的研究大都使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，作為真核表達(dá)

3、體系，該系統(tǒng)具備表達(dá)蛋白的加工和修飾能力，此，夕該系統(tǒng)發(fā)展成熟，表達(dá)產(chǎn)＼／量相對(duì)較高，操作簡(jiǎn)便，易于放大制備。硝本研究在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)首先進(jìn)行了VP6；UVP7蛋白的重組表達(dá)。PCR方法擴(kuò)增A組輪狀病毒我國(guó)地方株T114VP6基因及T73G1型VP7基因，分別克隆于桿狀病毒表達(dá)載體pBlueBac與分泌表達(dá)載體pMelBac中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pBlueBac—VP6、pMelBac—VP6、pBlueBac—VP7、pMelBac

4、—VP7cut51aa；重組載體與桿狀病毒線性DNA共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。空斑實(shí)驗(yàn)篩選重組病毒，病毒擴(kuò)增放大制備高滴度的第三代重組病毒，重組病毒感染Sf9細(xì)胞制備樣品，用豚鼠抗輪狀病毒wa株高價(jià)免疫血清經(jīng)Westernblot方法檢測(cè)四種重組病毒VP6、VP7蛋白的表達(dá)。含標(biāo)準(zhǔn)株VP2、地方株T114VP6年[J地方株T7361型VP7蛋白編碼基因的重組病毒以05MOI共感染Sf9細(xì)胞制備2／6／7病毒樣顆粒，待細(xì)胞完全裂解后收獲培養(yǎng)基