1、背景和目的：腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種常見且嚴重的腦卒中類型，其具有很高的發(fā)病率、致死率和致殘率。但是目前除了外科手術(shù)清除血腫和內(nèi)科脫水降顱內(nèi)壓外，尚無其它有效的治療方法來改善腦出血造成的神經(jīng)功能缺失。血管新生是指從原有的血管上生出新的毛細血管。本課題組近年來首次證實膠原酶誘導的腦出血血腫區(qū)存在明顯的血管新生，可能為損傷神經(jīng)元的修復、突觸重建創(chuàng)造良好的微環(huán)境，并有利于藥物直達病灶，充分發(fā)揮藥

2、物效應(yīng)。然而腦出血后血管新生的啟動機制尚不明確。凝血酶(thrombin)是一種多功能絲氨酸蛋白酶。體內(nèi)外實驗均證實凝血酶具有促進腫瘤血管新生的作用，并能上調(diào)許多血管新生調(diào)控因子的表達。目前關(guān)于凝血酶對腦出血后血管新生的作用國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究擬從凝血酶角度探討腦出血后血管新生的啟動機制，并進一步研究凝血酶對血管新生調(diào)控因子缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長

3、因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)、促血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)、Ang-2、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP-2)、MMP-9和整合素(integrin)αvβ3表達的影響，以初步闡明凝血酶啟動腦出血后血管新生的作用機制，將為臨床和基礎(chǔ)探索治療腦出血提供新的觀念和思路。
　　 方法：本研究主要分為2個部分。

4、(1)立體定位向腦內(nèi)蒼白球注入大鼠自體動脈血(100μL)復制腦出血模型。假手術(shù)組注入等體積生理鹽水。腦出血+水蛭素組在注入自體動脈血同時注入水蛭素5U。腹腔注射5-溴-2'-脫氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)進行標記。采用免疫組織化學方法檢測腦出血后BrdU+/von Willebrandfactor+(vWF)標記的新生血管密度變化及HIF-1α、VEGF、Ang-1、Ang-2、MMP-2、MMP-

5、9和整合素αvβ3的時空分布。分別運用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測腦出血后HIF-1α、VEGF、Ang-1、Ang-2、MMP-2、MMP-9和整合素αvβ3 mRNA和蛋白表達。(2)1U凝血酶立體定位注入右側(cè)蒼白球制作凝血酶模型，并腹腔注射BrdU標記。采用免疫組化方法檢測凝血酶損傷區(qū)BrdU+/vWF+標記新生血管密度變化和HIF-1α、VEGF、Ang-1、Ang-2、MMP-2、MMP-9和整合素αvβ3

6、的時空分布。
　　 結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示：假手術(shù)組各時間點未見BrdU、HIF-1α、Ang-2、MMP-2、MMP-9和整合素αvβ3的表達，偶見散在微弱的VEGF和Ang-1陽性血管。腦出血后3天血腫周圍即可以見到BrdU+/vWF+標記的細胞核，且持續(xù)增高至14天。在血腫周圍可見大量HIF-1α、VEGF、Ang-1、Ang-2、MMP-2、MMP-9和整合素αvβ3陽性血管；且HIF-1α、VEGF、Ang-1、Ang

7、-2、MMP-2、MMP-9和整合素αvβ3均表達于vWF陽性的血管內(nèi)皮細胞；熒光定量PCR結(jié)果顯示：腦出血后3天VEGF、Ang-1、Ang-2、MMP-2、MMP-9、整合素αv和β3 mRNA表達均較假手術(shù)組明顯升高。VEGF、Ang-1、整合素αv和β3 mRNA的表達持續(xù)增高至14天，而Ang-2、MMP-2和MMP-9 mRNA的表達隨后開始下降。HIF-1αmRNA在各組各時間點之間的表達無明顯差異。Western blo

8、t結(jié)果顯示：腦出血后3天HIF-1α、VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白表達也較假手術(shù)組明顯增高。HIF-1α和Ang-2蛋白表達從7天開始明顯降低，VEGF和Ang-1蛋白表達則持續(xù)增高至14天。在采用水蛭素干預后，BrdU+/vWF+標記的細胞核明顯減少，而且血腫周圍組織HIF-1α、VEGF、Ang-1、Ang-2、MMP-2、MMP-9和整合素αvβ3的表達均明顯降低。應(yīng)用1U凝血酶注入大鼠蒼白球，在其損傷區(qū)可檢測到BrdU標