1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和軟骨下骨組織的破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，最終造成關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直。RA是最常見(jiàn)的風(fēng)濕性疾病之一。不同RA患者的發(fā)病、病程及預(yù)后差異較大，嚴(yán)重者伴有多種并發(fā)癥，且病變持續(xù)惡化。因此，RA的早期診斷和積極治療尤為關(guān)鍵。 RA的詳細(xì)發(fā)病機(jī)制仍未闡明。一般認(rèn)為是某種未知抗原作用于有遺傳傾向的個(gè)體，

2、誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答，引發(fā)滑膜增生性病變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞。自身免疫應(yīng)答包括抗原遞呈、免疫細(xì)胞相互作用和免疫效應(yīng)三個(gè)階段，是一個(gè)由多種免疫細(xì)胞(抗原遞呈細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞)、分子(膜分子和可溶性分子)以及生物因子(細(xì)胞因子、炎性因子)參與并受到嚴(yán)格調(diào)控及制約的復(fù)雜生理過(guò)程。 越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞因子參與RA的整個(gè)病理過(guò)程，并在其中發(fā)揮重要作用。各種生物因子間的關(guān)系密切、作用復(fù)雜，其特點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)性和多相性。在RA不同的病理過(guò)程中參與

3、的生物因子不同。IFN-γ、GM-CSF等在RA的觸發(fā)階段起關(guān)鍵作用；T細(xì)胞向滑膜遷移受IL-15、IL-16的調(diào)控；IL-4、IL-10則作用于B細(xì)胞的激活和分化生長(zhǎng)。而IL-1、IL-8和TNF-α等炎癥因子在病變中起主導(dǎo)作用。 為進(jìn)一步探討細(xì)胞因子在RA中的免疫效應(yīng)機(jī)制，本文第一部分建立細(xì)胞因子實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)方法。將分離獲得的人外周血

4、PBMC置激發(fā)型CD3抗體包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，收取不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清和單個(gè)核細(xì)胞。分離獲得單個(gè)核細(xì)胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。特異性擴(kuò)增IL-2、IFN-γ和IL-10的基因片段，與PMD18-T載體連接，制備重組質(zhì)粒并定量。在優(yōu)化的PCR條件下，建立目的基因和內(nèi)參照基因(β-Actin)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中目的基因的mRNA表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)上清中相應(yīng)細(xì)胞因子的含量，研究其相關(guān)性。結(jié)果顯示：1.在優(yōu)化的PCR條

5、件下，目的基因和內(nèi)參照基因的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定可靠，在106、105、104和103 copies/ml濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系；2.受CD3抗體的激發(fā)，外周血單個(gè)核細(xì)胞胞漿目的基因的mRNA和相應(yīng)的培養(yǎng)上清中蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照；3.目的基因的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)有一定的相關(guān)性。 第二部分通過(guò)對(duì)活動(dòng)期和緩解期RA患者外周血中CD4+T細(xì)胞表面的共刺激分子和凋亡分子、多種細(xì)胞因子及其相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，進(jìn)

6、而探討這些免疫效應(yīng)分子與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病程發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示：1.急性活動(dòng)期RA患者外周血CD4+T細(xì)胞表面CD154、CD69的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組和RA穩(wěn)定期組，而健康對(duì)照組和RA穩(wěn)定期組之間無(wú)顯著差異；2.急性活動(dòng)期RA患者的血清和血漿sCD154水平均高于健康對(duì)照組和穩(wěn)定期RA患者組；3.不同細(xì)胞因子在健康對(duì)照組血清中的基準(zhǔn)水平不同，同樣外周血PBMC中其相應(yīng)的mRNA基準(zhǔn)水平也有顯著差異，細(xì)胞因子血清蛋白質(zhì)

7、基準(zhǔn)水平與其mRNA基準(zhǔn)水平完全不相關(guān)；4.急性活動(dòng)期RA患者IL-6、IFN-γ以及IL-10的血清含量與其外周血PBMC中其相應(yīng)的mRNA水平顯著升高，兩者之間有良好的相關(guān)性。 綜上所述，本研建究立了細(xì)胞因子熒光定量PCR的檢測(cè)方法。采用該檢測(cè)技術(shù)，分析急性活動(dòng)期RA患者外周血細(xì)胞因子及其mRNA的表達(dá)變化，證實(shí)細(xì)胞因子在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平之間的相關(guān)性。RA患者細(xì)胞因子及其mRNA的檢測(cè)，能為RA的臨床診斷、治療和