1、第一部分:地氟醚預處理對缺氧/復氧損傷內(nèi)皮細胞的保護作用 目的：了解缺氧/復氧(A/R)對人內(nèi)皮細胞的損傷作用，和地氟醚預處理對內(nèi)皮細胞的A/R損傷所起的保護作用。 方法：選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(ECV304)。將細胞分為5組：空白對照組(C組)，A/R組，A/R+腫瘤壞死因子-α(TNF-α，10ng/ml)刺激組(A/R+TNF-α組)，地氟醚1.0MAC預處理+A/R組(Des+A/R組)，地氟醚1.0MAC預處理

2、+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激組(Des+A/R+TNF-α組)。應用流式細胞儀碘化丙啶(PI)染色法、原位缺口末端標記(TUNEL)法、透射電鏡(EM)觀察法檢測各組內(nèi)皮細胞的凋亡和壞死。 結果：A/R組較對照組中的細胞凋亡和壞死率有一定增加；經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組的細胞凋亡和壞死率則顯著增加；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+A/R組、Des+AiR十TNF-α組細胞較相應無預處理的A/R組、A/R+

3、TNF-α組，其細胞凋亡和壞死率有明顯減少：透射電鏡觀察到，A/R組和A/R+TNF-α組，可見較多的細胞壞死現(xiàn)象：細胞腫脹、細胞內(nèi)超微結構破壞，大量空泡出現(xiàn)，核染色質(zhì)溶解或核碎裂、細胞膜破壞明顯。而兩組地氟醚預處理后的細胞結構正常，胞內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，核仁增多明顯，細胞處于增殖和修復狀態(tài)。 結論：地氟醚預處理可抑制內(nèi)皮細胞缺氧/復氧引起的細胞死亡、減少細胞損傷、加強細胞修復和增殖，從而具有一定的保護作用。第二部分：

4、 目的：探討預處理對內(nèi)皮細胞NF-kB活性的影響；并進一步分析NF-kB信號通路中一系列關鍵轉導蛋白表達的變化，以明確地氟醚預處理對內(nèi)皮細胞A/R損傷所起保護作用的分子機制，為臨床麻醉實施中預防缺血再灌注損傷的麻醉藥物選擇提供實驗和理論依據(jù)。 方法：選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(ECV304)。將細胞分為5組：空白對照組(C組)，A/R組，A/R+腫瘤壞死因子-α(TNF-a，10ng/ml)刺激組(A/R+TNF-α組)，地氟

5、醚1.0MAC預處理+A/R組(Des+A/R組)，地氟醚1.0MAC預處理+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激組(Des+A/R+TNF-α組)。采用間接免疫熒光法檢測各組細胞中NF-kB/p65亞基的定位；應用核漿分離技術和Western blot分析法檢測NF-kB/p65亞基在各組細胞核內(nèi)的蛋白表達水平；應用Western blot分析法檢測各組細胞NF-kB信號途徑中，kB抑制因子-β(IkB-α)的降解以及磷酸化IkB

6、-α(p-IkB-α)、磷酸化IkB激酶α/β(p-IKKa/IKKβ)的表達；以腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)抗體免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)并用Western blot法檢測各組細胞膜受體信號轉導復合體中，TNFR1與腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor-associatd factor 2，TRAF2)及IkB激酶α(IKKα)的蛋白結合水平；應用

7、流式細胞術檢測各組內(nèi)皮細胞膜表面TNFRl的表達。 結果：間接免疫熒光分析法顯示對照組細胞NF-kB/p65亞基免疫熒光標記分布于胞漿區(qū)；A/R組可見部分免疫熒光標記由胞漿區(qū)轉入核區(qū)；經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組細胞的NF-kB/p65亞基免疫熒光標記幾乎全部入核；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+A/R組的免疫熒光標記入核較A/R組有明顯減少；Des+A/R+TNF-α組的免疫熒光標記的入核亦較相應的A/R+TNF-α組

8、有明顯減少。應用核漿分離技術、Western blot分析法定量檢測，進一步確證了免疫熒光分析法的結果。Western blot分析法檢測各組細胞中IkBα含量，可見A/R組較對照組IkBa有一定減少；經(jīng)TNF-α刺激后，可見顯著減少；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+A/R組較A/R組的IkBa有顯著增加。同樣，Des+A/R+TNF-α組則較相應未經(jīng)預處理的A/R+TNF-α組有顯著增加；而Des+A/R、Des+A/R+TNF-α組間無

9、顯著差異。同法，檢測細胞中p-IkBα、p-IKKα/IKKβ含量。結果提示，A/R組細胞中三種關鍵轉導蛋白含量均較對照組有一定增加；經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組中可見顯著增加；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+A/R組較A/R組中p-IkBα含量有顯著減少；Des+A/R十TNF-α組亦較相應未經(jīng)預處理的A/R+TNF-α組有顯著減少。應用免疫共沉淀-Western blot法檢測各組細胞TNFR1與TRAF2及IKKα的蛋白

10、結合水平?？梢夾/R組細胞轉導復合體中招募TRAF2蛋白及激活IKKα蛋白的含量較對照組有一定增加：經(jīng)TNF-α刺激后，A/R+TNF-α組中可見顯著增加；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+A/R組較A/R組中所招募TRAF2及激活IKKα的蛋白含量有顯著減少；Des+A/R+TNF-α組亦較相應未經(jīng)預處理的A/R+TNF-α組有顯著減少。應用流式細胞術檢測了內(nèi)皮細胞膜表面TNFR1的表達，可見未經(jīng)處理的對照組細胞，其膜表面的TNFR1呈高表

11、達；缺氧/復氧損傷后，受體表達沒有明顯變化；經(jīng)TNF-α外源性刺激后，受體內(nèi)吞顯著加強，參與介導激活NF-kB信號轉導通路；而經(jīng)地氟醚預處理的后兩組，分別與相對應的無預處理組比較，其膜表面TNFR1的表達無顯著性差異；即使是經(jīng)過地氟醚預處理的內(nèi)皮細胞，其在外源性TNF-α刺激下，仍可見受體內(nèi)吞有顯著加強。 結論：A/R損傷可激活內(nèi)皮細胞中NF-kB的活性，而地氟醚預處理可抑制這種由TNF-α介導的NF-kB信號通路的激活。這一調(diào)

12、節(jié)作用可能是地氟醚預處理對內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷所起保護作用的分子機制之一。而地氟醚預處理對NF-kB出信號通路產(chǎn)生抑制的始動作用位點，在于TNF膜受體信號轉導復合體中對TNFR1對于TRAF2蛋白的招募，而非影響膜受體TNFR1本身的表達。第三部分：地氟醚預處理對缺氧/復氧損傷時NF-kB轉導通路效應分子的影響 目的：了解地氟醚預處理對內(nèi)皮細胞A/R損傷時炎性介質(zhì)分子和黏附分子表達的變化趨勢，探討預處理對于NF-kB信號轉導

13、通路激活后的效應分子的影響。 方法：選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(ECV304)。將細胞分為5組：空白對照組(C組)，A/R組，A/R+腫瘤壞死因子-α(TNF-α，10ng/ml)刺激組(A/R+TNF-α組)，地氟醚1.0MAC預處理+A/R組(Des+A/R組)，地氟醚1.0MAC預處理+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激組(Des+A/R+TNF-α組)。應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法分別檢測各組細胞的細胞間