1、目的：
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離于低氧環(huán)境下的骨髓（含氧1～7％），缺氧誘導(dǎo)因子-1 alpha(hypoxia-inducible factor1 alpha，HIF-1 alpha)是低氧適應(yīng)病理反應(yīng)中的一個(gè)特異的調(diào)節(jié)因子和缺氧誘導(dǎo)條件下基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中信息傳遞的共同通路。在機(jī)體適應(yīng)缺氧環(huán)境的過(guò)程中，HIF-1 alpha起著關(guān)鍵的作用。正畸過(guò)程中施加的機(jī)械力在牙槽骨和牙根之間造成局部的缺氧環(huán)境，而局部微環(huán)境缺氧是啟動(dòng)骨改建的重

2、要因素之一。然而，力環(huán)境下HIF-1 alpha對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響是一個(gè)重要研究課題，其作用機(jī)理不明，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。綜觀此領(lǐng)域的現(xiàn)有工作:目前關(guān)于周期性張應(yīng)力介導(dǎo)下HIF-1 alpha對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用的研究還很不充分，對(duì)周期性張應(yīng)力介導(dǎo)下HIF-1 alpha對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)理的闡述有利于指導(dǎo)臨床醫(yī)生采用不同的手段和方法調(diào)控或誘導(dǎo)骨改建，對(duì)臨床干預(yù)具有重要的指導(dǎo)意義，這正是實(shí)現(xiàn)正畸

3、牙齒最優(yōu)化移動(dòng)亟需解決的問(wèn)題。
　　本研究首先擬建立大鼠單側(cè)上頜正畸牙齒移動(dòng)模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIF-1alpha在受力區(qū)域的表達(dá)變化，研究牽張環(huán)境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表達(dá)水平;同時(shí)進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)，構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型，施加相同頻率，不同力值大小和持續(xù)時(shí)間的動(dòng)態(tài)張應(yīng)力刺激，根據(jù)張應(yīng)力力值和時(shí)間與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化之間的關(guān)系，篩選出促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的最適張

4、應(yīng)力;并在此基礎(chǔ)上，采用慢病毒包裝質(zhì)粒構(gòu)建沉默表達(dá)HIF-1 alpha的穩(wěn)定細(xì)胞系，對(duì)其施以最適成骨的張應(yīng)力刺激，研究HIF-1 alpha在周期性張應(yīng)力介導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中的作用，并推測(cè)其可能的調(diào)控機(jī)制;明確力、HIF-1 alpha、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化三者之間的關(guān)系。本課題試圖闡明力學(xué)因素在調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的重要作用，從細(xì)胞力學(xué)角度揭示HIF-1 alpha在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

5、成骨分化過(guò)程中的作用機(jī)制，為臨床正畸矯治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.觀察牽張力環(huán)境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表達(dá)變化:
　　成功地建立大鼠上頜單側(cè)正畸牙移動(dòng)模型，分別在未加力、加力1d、3d、7d、14d、28d時(shí)，處死大鼠，經(jīng)組織固定、脫鈣后，制作上頜右側(cè)第一磨牙牙周組織切片，行HE染色觀察其牙周組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)進(jìn)行半定量分析HIF-1 alpha和其下游基因VEGF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正

6、常大鼠的牙周組織中基本上未見(jiàn)有明顯的HIF-1 alpha的陽(yáng)性表達(dá)，其下游靶基因VEGF表達(dá)也較弱;在正畸加力組中可見(jiàn)HIF-1 alpha的表達(dá)增強(qiáng)，并且表達(dá)強(qiáng)度變化貫穿正畸牙周組織改建的全過(guò)程，靠近牙骨質(zhì)和牙槽骨表面的牙周膜區(qū)域強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，中間部分的牙周膜也呈陽(yáng)性表達(dá); VEGF表達(dá)雖不如HIF-1 alpha的強(qiáng)，但也隨加力時(shí)間延長(zhǎng)有增強(qiáng)趨勢(shì)。從而確定HIF-1 alpha參與了大鼠牙齒移動(dòng)過(guò)程中牙周組織的改建，在正畸牙移動(dòng)的機(jī)

7、制中具有重要意義。
　　2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定:
　　將全貼壁法分離的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)體外分離培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增的方式獲得原代大鼠BMSCs。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，MTT法檢測(cè)其增殖能力，LIVE/DEAD法檢測(cè)細(xì)胞的活力，有限稀釋法結(jié)晶紫染色證明其克隆形成能力;并將細(xì)胞分別用成骨誘導(dǎo)液及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)，通過(guò)茜素紅染色、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色及油紅O染色

8、證明其多向分化能力。從而對(duì)得到的大鼠BMSCs進(jìn)行細(xì)胞活性及干性的鑒定。
　　3.確定最適體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的周期性張應(yīng)力條件:成功的構(gòu)建了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)-周期性張應(yīng)力加載力學(xué)刺激模型，并將細(xì)胞分為不加力組和加力組，其中加力組按1％、5％、15％的不同作用力值，以及0.5h、2h、6h、8h、12h的不同持續(xù)時(shí)間分為15組，分別施加周期性張應(yīng)力，作用力頻率均為1Hz。加力結(jié)束后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ALP堿性磷

9、酸酶活性檢測(cè)，根據(jù)OD值篩選出最適宜大鼠BMSCs成骨分化的加力條件為1Hz頻率、5％拉伸強(qiáng)度，并加載6h。
　　4.觀察周期性張應(yīng)力加載下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)HIF-1 alpha在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化:
　　在體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs內(nèi)HIF-1 alpha表達(dá)很弱，但經(jīng)周期性張應(yīng)力刺激可促進(jìn)其在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，且隨加力時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)，mRNA水平表達(dá)變化與蛋白水平表達(dá)變化呈現(xiàn)較為一致的趨勢(shì)。表明H

10、IF-1 alpha可對(duì)力學(xué)刺激做出陽(yáng)性表達(dá)反應(yīng)。
　　5.穩(wěn)定沉默表達(dá)HIF-1alpha的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定:
　　本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)大鼠HIF-1alpha基因序列設(shè)計(jì)了四個(gè)shRNA干擾靶點(diǎn)，并根據(jù)其基因序列設(shè)計(jì)并合成了四對(duì)含干擾序列的寡聚單鏈DNA，然后將其退火成雙鏈，插入shRNA慢病毒載體中，構(gòu)建四個(gè)shRNA慢病毒重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5 alpha，經(jīng)測(cè)序鑒定均為陽(yáng)性克隆。之后進(jìn)行慢病毒

11、包裝，病毒原液的收集和超濾濃縮，以及病毒滴度的測(cè)定。最后，用包裝好的四組shRNA慢病毒以及陰性對(duì)照的慢病毒分別感染大鼠BMSCs，通過(guò)Western Blotting評(píng)價(jià)干擾載體對(duì)靶基因的干擾效果，再向沉默表達(dá)HIF-1alpha的大鼠BMSCs再次轉(zhuǎn)染HIF-1alpha質(zhì)粒，造成目的基因的過(guò)表達(dá)，通過(guò)Western blotting驗(yàn)證靶基因的回復(fù)效應(yīng)，表明本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不是由于脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的。選擇沉默效果最好的shRNA4感染后的

12、靶細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定株，對(duì)穩(wěn)定株細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖活性及成骨分化能力鑒定均成功。
　　6.觀察HIF-1 alpha在周期性張應(yīng)力大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的作用:
　　對(duì)正常細(xì)胞、沉默表達(dá)HIF-1 alpha的細(xì)胞、陰性對(duì)照感染的細(xì)胞分別進(jìn)行最適力值的刺激，即加載1Hz頻率、5％拉伸強(qiáng)度的周期性張應(yīng)力6h，采用qPCR和Western blotting檢測(cè)三組細(xì)胞加力后的ALP活性，及成骨樣基因骨鈣素(Osteocalc

13、in，OCN)、骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）、骨涎蛋白(Bone sialoprotein，BSP)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor2，RUNX2）、Osterix基因的mRNA和蛋白表達(dá)變化。正常大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)ALP，沉默表達(dá)HIF-1 alpha后，ALP表達(dá)活性升高(P＜0.05)，但對(duì)照組細(xì)胞ALP表達(dá)未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。正常大鼠骨髓間充

14、質(zhì)干細(xì)胞有OCN、OPN、BSP、RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表達(dá)，沉默表達(dá)HIF-1 alpha后，OCN、OPN、BSP、RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05)，但對(duì)照組細(xì)胞OCN、OPN、BSP、RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。
　　同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞HIF-1 alpha，及其下游基因VEGF和TWIST的mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)正常大

15、鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有VEGF、TWIST和HIF-1 alpha的mRNA和蛋白表達(dá)，沉默表達(dá)HIF-1 alpha后VEGF和TWIST的表達(dá)量也有所減少(P＜0.05)，但對(duì)照組細(xì)胞未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。推測(cè)成骨樣因子的變化可能與HIF-1 alpha下游基因VEGF和TWIST有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　結(jié)論：
　　1.HIF-1 alpha在大鼠單側(cè)上頜牙齒移動(dòng)模型中的表達(dá)有明顯變化，從而確定其參

16、與了大鼠牙齒移動(dòng)過(guò)程中牙周組織的改建，在正畸牙齒移動(dòng)的機(jī)制中具有重要意義。
　　2.周期性張應(yīng)力刺激可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨向分化，最適加力條件為1Hz頻率、5％拉伸強(qiáng)度，并加載6h。在該過(guò)程中HIF-1 alpha在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均增強(qiáng)，且隨加力時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)，表明HIF-1 alpha可對(duì)力學(xué)刺激作出陽(yáng)性反應(yīng)，從細(xì)胞水平證實(shí)HIF-1 alpha參與了力環(huán)境下成骨分化的過(guò)程。
　　3.沉默表達(dá)HIF