1、肺癌是當(dāng)前世界各國常見的惡性腫瘤之一,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的75％~85%,針對(duì)晚期NSCLC的治療,目前已經(jīng)開始從傳統(tǒng)化療藥物治療轉(zhuǎn)變到分子靶向治療的新階段。吉非替尼(Gefitinib)是晚期NSCLC治療的首個(gè)靶向藥物,具有特異性好,起效快,不良反應(yīng)少的特點(diǎn)。雖然吉非替尼對(duì)NSCLC患者顯示出較好的治療效果,但由于耐藥問題的存在嚴(yán)重限制了本藥的應(yīng)用。
　　STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化蛋白家族( Signal tr

2、ansducers and activators of transcription,STAT)的一員,廣泛表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中,介導(dǎo)多種細(xì)胞因子信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳導(dǎo),影響眾多靶基因的轉(zhuǎn)錄。有報(bào)道稱,STAT3的siRNA或抑制劑如JSI-124、AG490、Stattic等,通過抑制STAT3激活,增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性,改善了吉非替尼在NSCLC細(xì)胞中的作用。但是,STAT3介導(dǎo)吉非替尼耐藥的機(jī)制還不是很明確,需

3、要進(jìn)一步研究。
　　本文選用幾種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株,觀察吉非替尼作用后對(duì)細(xì)胞中EGFR和STAT3活性的影響,并采用Western blot、RNA干擾、免疫共沉淀等方法深入研究STAT3抵抗吉非替尼作用的機(jī)制。
　　第一部分、STAT3持續(xù)激活抵抗吉非替尼的作用
　　本部分的實(shí)驗(yàn)主要是在細(xì)胞水平上比較了幾種非小細(xì)胞肺癌中STAT3的活性,并觀察吉非替尼作用后對(duì)幾種非小細(xì)胞肺癌中EGFR及STAT3活性的影響。結(jié)果表明

4、在帶有EGFR突變的H1975、HCC827細(xì)胞中STAT3的活性明顯強(qiáng)于EGFR野生型的A549細(xì)胞。雖然吉非替尼能夠顯著抑制H1975、HCC827以及A549細(xì)胞中EGFR的磷酸化,然而在相同的濃度及時(shí)間下吉非替尼對(duì)這三種細(xì)胞中STAT3的705位酪氨酸的磷酸化并沒有顯著的抑制作用。提示,STAT3的異?；罨赡苡绊懠翘婺岬淖饔?。同時(shí)聯(lián)合運(yùn)用STAT3的抑制劑Stattic和吉非替尼后能夠顯著增強(qiáng)吉非替尼抑制H1975細(xì)胞增殖的

5、作用。進(jìn)一步證明STAT3持續(xù)激活影響了吉非替尼在H1975細(xì)胞中的作用。
　　第二部分、STAT3持續(xù)激活抵抗吉非替尼作用的機(jī)制
　　1、EGFR突變對(duì)STAT3抵抗吉非替尼作用的影響
　　本文成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了表達(dá)EGFR外顯子20插入突變的NIH3T3細(xì)胞株。隨后利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞中過表達(dá)的EGFR促進(jìn)了p705-STAT3的磷酸化,且發(fā)現(xiàn)這種活化的STAT3可以被吉非替尼

6、所抑制。說明STAT3持續(xù)激活抵抗吉非替尼的作用具有細(xì)胞選擇性。
　　進(jìn)一步利用RNA干擾EGFR研究H1975細(xì)胞中EGFR對(duì)STAT3活性的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)EGFR的shRNA轉(zhuǎn)染H1975細(xì)胞后,EGFR表達(dá)減少,相應(yīng)的STAT3的705位的磷酸化的水平出現(xiàn)明顯下調(diào),表明STAT3持續(xù)激活抵抗吉非替尼的作用與H1975細(xì)胞中EGFR自身分子表達(dá)有關(guān)。
　　2、Gp130/JAK信號(hào)通路對(duì)STAT3持續(xù)激活的影響
　　

7、Gp130/JAK信號(hào)通路是激活STAT3的主要通路,本部分實(shí)驗(yàn)比較了A549、H1975細(xì)胞中JAK1與JAK2的活性,發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞中JAK1與JAK2的活性沒有顯著性的差異,但是發(fā)現(xiàn)H1975細(xì)胞中JAK1/JAK2異二聚體的形成明顯多于A549細(xì)胞,這可能是H1975中STAT3高活化的一個(gè)因素。進(jìn)而檢測JAK1與JAK2上游gp130受體對(duì)STAT3活性的影響,發(fā)現(xiàn)在H1975細(xì)胞中利用RNA干擾敲除gp130,相應(yīng)地阻斷了S

8、TAT3(Y705)的磷酸化,表明STAT3持續(xù)激活抵抗吉非替尼的作用與H1975細(xì)胞中g(shù)p130表達(dá)有關(guān)。
　　Gp130是細(xì)胞因子的膜上受體,介導(dǎo)gp130/JAK/STAT3信號(hào)通路傳導(dǎo),促進(jìn)STAT3的激活。因此利用細(xì)胞因子芯片首先檢測了H1975細(xì)胞中一些細(xì)胞因子的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在H1975細(xì)胞分泌上清中只有IL-6與STAT3的聯(lián)系最為密切。為了發(fā)現(xiàn)其它的可能影響STAT3激活的細(xì)胞因子,利用放線菌酮作用H1975細(xì)胞

9、,發(fā)現(xiàn)其條件培養(yǎng)基不能阻斷H1975細(xì)胞中STAT3的激活。然而FBS(含IL-6)以及外加重組表達(dá)IL-6作用H1975細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)均不影響H1975細(xì)胞中STAT3的激活。上述實(shí)驗(yàn)表明,H1975細(xì)胞中STAT3的激活不依賴于細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞因子。
　　上述研究表明STAT3的激活與H1975細(xì)胞中的EGFR以及gp130分子有關(guān),而與其分泌的細(xì)胞因子IL-6無關(guān),說明H1975細(xì)胞內(nèi)存在STAT3的自身異常激活?？紤]到H1

10、975細(xì)胞是一個(gè)EGFR突變的細(xì)胞,EGFR/HER2異二聚體形成遠(yuǎn)高于A549且EGFR/HER2異二聚體能夠通過HER2介導(dǎo)STAT3的激活。為了探討gp130、EGFR與HER2三者之間的關(guān)系,我們利用RNA干擾gp130,研究其對(duì)H1975細(xì)胞中EGFR/HER2異二聚化形成的影響。研究表明,gp130敲除后, EGFR與HER2的結(jié)合明顯減少,提示gp130參與了EGFR/HER2異二聚化的形成。進(jìn)一步說明了STAT3的持續(xù)激

11、活與gp130/EGFR/HER2復(fù)合分子的形成有關(guān)。
　　3、吉非替尼作用對(duì)H1975細(xì)胞中socs-3的影響
　　細(xì)胞內(nèi)STAT3激活還與細(xì)胞內(nèi)源性的多種負(fù)向調(diào)控有關(guān)。因此采用Western bloting方法進(jìn)一步對(duì)影響gp130/JAK/stat3通路的內(nèi)源性負(fù)向調(diào)控分子socs-3進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉非替尼能夠時(shí)間依賴性抑制H1975細(xì)胞中socs-3的表達(dá),解除了STAT3的一個(gè)重要的細(xì)胞中內(nèi)源性負(fù)向調(diào)控,維持

12、細(xì)胞中STAT3的持續(xù)激活。這種作用與吉非替尼抑制ERK1/2活化有著密切的關(guān)系。
　　本論文研究表明H1975細(xì)胞 gp130/EGFR/HER2復(fù)合物的形成,促進(jìn)了EGFR/HER2通路與gp130/JAK通路相互對(duì)話,引起JAK1/JAK2二聚化增多,最終導(dǎo)致STAT3組成型激活,同時(shí)吉非替尼作用抑制了細(xì)胞中socs-3的表達(dá),影響了該通路的內(nèi)源性負(fù)向調(diào)控,從而維持細(xì)胞中STAT3持續(xù)活化。綜上所述, H1975細(xì)胞中STA

13、T3由于存在不依賴EGFR活化的激活,而對(duì)吉非替尼作用形成原發(fā)性抵抗;同時(shí)吉非替尼作用后抑制了socs-3的表達(dá),減少了針對(duì)STAT3的內(nèi)源性負(fù)向調(diào)控,形成對(duì)吉非替尼作用的繼發(fā)性抵抗;兩方面共同作用促進(jìn)了STAT3持續(xù)活化,從而介導(dǎo)其抵抗吉非替尼的作用。本論文研究結(jié)果明確了STAT3持續(xù)激活參與吉非替尼作用抵抗的機(jī)制,表明抑制gp130/EGFR/HER2復(fù)合物的形成是降低STAT3活化的一條重要途徑,這為今后開發(fā)拮抗吉非替尼耐藥藥物提