1、目的：
　　 分別構(gòu)建含乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白與BALB/c鼠細(xì)胞間粘附分子(Intracellular adhesion molecule-1,ICAM-1)編碼基因以及單純ICAM-1編碼基因重組質(zhì)粒,比較ICAM-1編碼基因不同構(gòu)建方式對(duì)乙腦DNA疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的免疫佐劑效應(yīng)并探究ICAM-1編碼基因免疫增強(qiáng)效應(yīng)機(jī)制。
　　 材料和方法
　

2、　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、細(xì)胞與動(dòng)物
　　 中國(guó)倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞與鼠肥大細(xì)胞瘤(P815)細(xì)胞分別購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫,雌性、4周齡BALB/c鼠購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。
　　 2、質(zhì)粒與菌株
　　 含JEV prME 白基因的重組質(zhì)粒被命為pJME,由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；原核表達(dá)載體pMD19-T simple和真核表達(dá)載體

3、pcDNA3.1(+)分別購自Takara寶生物工程(大連)公司和美國(guó)Invitrogen公司。大腸桿菌JM109與DH5a購自Takara公司。
　　 3、其他試劑
　　 質(zhì)粒抽提試劑盒購自QIAGEN公司,Lipofectamine2000購自Invitrogen公司,山羊抗鼠ICAM-1購自Santa公司,異硫氰酸熒光素(FITC)以及辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG均購自北京中杉公司,乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購自

4、美國(guó)Promega公司。熒光標(biāo)記的抗體(CD3-PerCP,CD4-APC,CD8-PE,CD54-PE,CD11c-APC,MHCⅡ-FITC,CD80-PE,CD86-FITC)均購自美國(guó)BD PharMingen公司。熒光染料羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-Dextran)均購自美國(guó)Molecular Probes公司。Mouse T Cell Lympholyte-Pure購自加

5、拿大Cedarlane公司。絲裂霉素C購自美國(guó)Sigma公司。rmIL-2購自美國(guó)Peprotech公司。新霉素類似物(G418)購GiBCO公司,限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI以及NotI等均購自Takara公司。IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γELISA試劑盒均購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。ECL發(fā)光試劑盒購自美國(guó)Pierce公司。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、pICAM-1、pJME/ICAM-1

6、的構(gòu)建和鑒定
　　 從BALB/c鼠脾臟細(xì)胞中提取總RNA,參照(Genbank X52264.1),以總RNA為模板,采用套式-RT-PCR法擴(kuò)增ICAM-1CDS區(qū)域序列(1614bp),將后者克隆到pcDNA3.1(+)(EcoRI/NotI),構(gòu)建重組質(zhì)粒pICAM-1。限制性內(nèi)切酶BamHI/EcoRI酶切pJME,獲取JEV prME基因(2001bps)并克隆到pICAM-1 BamHI/EcoRI之間,構(gòu)建融合p

7、JME/ICAM-1。后者通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、提取、電泳、測(cè)序以及酶切等方法進(jìn)行鑒定。
　　 脂質(zhì)體法將pJME/ICAM-1轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞,于轉(zhuǎn)染后72h,經(jīng)G418(800μg/mL)進(jìn)行細(xì)胞篩選7d,再經(jīng)G418(400μg/mL)持續(xù)篩選4周并獲得CHO細(xì)胞陽性克隆,采用免疫熒光和免疫印跡法檢到ICAM-1以及融合蛋白prME/ICAM-1的表達(dá)。
　　 2、動(dòng)物和免疫程序
　　 每組8只BALB

8、/c鼠(購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)共5組。分別將溶于100μL滅菌PBS的不同免疫原鼠后肢肌內(nèi)注射,包括:pJME、pJME/ICAM-1、pJME+plCAM-1、pcDNA3.1(+)(陰性對(duì)照)各100μg以及腹腔注射JE滅活疫苗組(陽性對(duì)照)。JE滅活疫苗(JEV北京株,遼寧省疾病控制中心惠贈(zèng))100μL/次(相當(dāng)于1/5成人劑量),共免疫3次,間隔2周。
　　 3、小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的分離
　

9、　 脫頸法處死小鼠,無菌打開腹腔,取出脾臟放入冷PBS中,將其捻碎并濾過100目無菌鋼網(wǎng),收集脾細(xì)胞懸液,按照產(chǎn)品說明書操作制備脾臟T淋巴細(xì)胞；另取部分上述脾細(xì)胞懸液,1300 r/min洗滌5 min×3次；用完全培養(yǎng)基20 mL重懸細(xì)胞于250 mL培養(yǎng)瓶(Falcon公司)中,37℃,5％C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；用完全培養(yǎng)基20 mL劇烈洗搖培養(yǎng)瓶,并吸棄懸液,共4次；加入完全培養(yǎng)基20 mL,37℃,5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過

10、夜；收集懸浮細(xì)胞。
　　 4、脾臟樹突狀細(xì)胞表型和功能
　　 取制備脾臟DC細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子CD54、CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86,DC攝取FITC-Dextran能力以及DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力。
　　 5、T淋巴細(xì)胞亞群與CTL功能檢測(cè)
　　 取制備脾臟T淋巴細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀分析鼠脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群特點(diǎn),乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)CTL活性。
　　 6、EL

11、ISA法檢測(cè)T細(xì)胞、DC分泌細(xì)胞因子水平
　　 操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行,顯色后即刻用WellscanMK3酶標(biāo)儀(Lab-systems公司)檢測(cè)492nm波長(zhǎng)的吸光度A值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了融合表達(dá)重組質(zhì)粒pJME/ICAM-1以及單質(zhì)粒pICAM-1,并能在真核細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)目的蛋白；
　　 2、ICAM-1編碼基

12、因能夠促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,促使CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化；
　　 3、ICAM-1編碼基因能夠增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)；
　　 4、樹突狀細(xì)胞能夠通過ICAM-1編碼基因調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡；
　　 5、ICAM-1編碼基因能夠促進(jìn)JE DNA疫苗脾臟DC的成熟；
　　 6、ICAM-1編碼基因能夠提供獨(dú)立或放大B7分子的協(xié)同刺激信號(hào)；
　　 7、相對(duì)于聯(lián)合免疫組,融合質(zhì)粒免疫