1、目的： 卵巢是維持女性生殖和內(nèi)分泌的性腺器官，容易受到治療原發(fā)病過(guò)程如癌癥的放化療或手術(shù)等引起的卵巢早衰而導(dǎo)致患者內(nèi)分泌失調(diào)、生育能力的喪失，卵巢組織的冷凍保存及移植技術(shù)的發(fā)展為卵巢功能受損患者恢復(fù)卵巢功能帶來(lái)了希望。與其它的組織器官移植一樣，供源的短缺是目前臨床面臨的很重要的問(wèn)題。胎兒卵巢組織因其含有大量原始卵泡，對(duì)冷凍損傷的耐受性強(qiáng)，免疫原性低等特點(diǎn)，是目前較理想的人卵巢組織移植的潛在供源。而建立人卵巢組織庫(kù)并將其應(yīng)用于臨床

2、尚需進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)研究，如完善胎兒卵巢組織的凍融方法和克服移植過(guò)程中的缺血-再灌注和血管重建導(dǎo)致卵泡大量丟失的問(wèn)題以及如何促進(jìn)原始卵泡的發(fā)育成熟等。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)及其共同的受體-表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在卵巢組織中廣泛存在，它們的結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，在卵泡的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用光學(xué)顯微鏡，免疫組化方法進(jìn)行以下方面的評(píng)價(jià)：1.凍融人胎兒卵巢組織異種移植后卵泡的存活及生長(zhǎng)發(fā)育；2

3、.凍融人胎兒卵巢組織異種移植早期血管的生成；3.EGFR在人胎兒卵巢組織原始卵泡中的分布和表達(dá)以及凍融異種移植前后EGFR在卵泡中表達(dá)的變化；4.孕馬血清促性腺激素(PMSG)對(duì)異種移植后的卵巢組織內(nèi)卵泡發(fā)育和血管重建及EGFR表達(dá)的影響。通過(guò)以上研究為建立人胎兒卵巢組織庫(kù)及其將來(lái)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法： 實(shí)驗(yàn)按卵巢組織凍融與否分為新鮮組與凍融組；凍融卵巢組織移植后裸鼠腹腔注射生理鹽水組為對(duì)照組，裸鼠腹腔注

4、射PMSG組為PMSG組，每組9只，共18只。取妊娠22周因故引產(chǎn)的胎兒卵巢組織片經(jīng)過(guò)慢凍、速融后異種移植至雄性裸鼠的雙側(cè)腎被膜下。對(duì)照組自移植當(dāng)天起隔日腹腔注射生理鹽水0.3ml/只：PMSG組自移植當(dāng)天起隔日腹腔注射PMSG5IU/只。分別于移植后2d、7d和28d三個(gè)時(shí)間段回收移植物，所有的卵巢組織標(biāo)本石蠟包埋后5um連續(xù)切片、HE染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察凍融前后及異種移植卵巢組織卵泡的結(jié)構(gòu)和數(shù)量；免疫組化法檢測(cè)EGFR在卵巢組織

5、中的分布及在卵泡中的表達(dá)變化，陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(MOD)表示其表達(dá)強(qiáng)弱；免疫組化法檢測(cè)CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞用以記數(shù)微血管密度(MVD)。 結(jié)果： 一、胎兒卵巢組織的凍融實(shí)驗(yàn) 1.光學(xué)顯微鏡觀察胎兒卵巢組織凍融前后均以原始卵泡為主，新鮮組與凍融組比較(24.85±7.95)vs(22.74±6.81)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。凍融過(guò)程未造成胎兒卵巢組織中的原始卵泡和微血管明顯可見(jiàn)的損傷。

6、2.免疫組化檢測(cè) 2.1MVD的免疫組化檢測(cè) 凍融前后的卵巢組織中的MVD無(wú)明顯變化，新鮮組與凍融組比較(19.57±4.56)vs(17.96±5.17)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.2EGFR免疫組化檢測(cè)結(jié)果 在胎兒卵巢組織中卵母細(xì)胞胞漿和胞膜中EGFR免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)，在顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)弱；凍融前后EGFR在卵巢組織中的表達(dá)無(wú)明顯變化，新鮮組和凍融組的MOD分別為：(0.176

7、6±0.0182)vs(0.1800±0.0143)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 二、凍融胎兒卵巢組織的移植實(shí)驗(yàn) 1.光學(xué)顯微鏡觀察 移植后PMSG組和對(duì)照組卵巢組織中的原始卵泡密度明顯下降，移植后2d、7d和28d，PMSG組(12.70±3.90、11.06±3.05、10.07±3.39)及對(duì)照組(14.05±4.59、13.83±4.03、12.04±3.43)，與新鮮組和凍融組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義(P＜0.05)。移植后7d、28d相對(duì)應(yīng)時(shí)間段PMSG組和對(duì)照組原始卵泡密度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。存活的原始卵泡中部分卵泡隨移植時(shí)間的延長(zhǎng)體積增大。2d、7d和28d該時(shí)間段所有標(biāo)本中的初級(jí)卵泡數(shù)，PMSG組分別為2個(gè)、4個(gè)和10個(gè)，對(duì)照組分別為3個(gè)、4個(gè)和12個(gè)，但均未見(jiàn)次級(jí)卵泡。 2.免疫組化檢測(cè) 2.1MVD的免疫組化檢測(cè) MVD在移植后兩組中的變化趨勢(shì)一致：2d時(shí)上升，7d時(shí)達(dá)高

9、峰，28d時(shí)下降，但仍維持在較高水平。2d及28d，PMSG組與對(duì)照組MVD分別為(3/1.22±7.37)vs(22.51±5.86)、(40.00±7.67)vs(29.56±6.63)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.2EGFR免疫組化檢測(cè)結(jié)果 移植后2d、7d，EGFR免疫反應(yīng)陽(yáng)性卵母細(xì)胞中的MOD，PMSG組與對(duì)照組分別為(0.1789±0.0154)vs(0.1726±0.0092)、(0.1841

10、±0.0154)vs(0.1817±0.0164)，兩組相應(yīng)時(shí)間段比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。移植后28d，PMSG組和對(duì)照組比較：(0.2307±0.0227)vs(0.2030±0.0221)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.人胎兒卵巢組織能耐受慢凍-速融過(guò)程，大部分原始卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好，但在異種移植過(guò)程中缺血缺氧導(dǎo)致相當(dāng)數(shù)量原始卵泡的丟失，存活的原始卵泡仍具有繼續(xù)發(fā)育的能力。

11、 2.胎兒卵巢組織異種移植后2天內(nèi)即開(kāi)始血管的重建過(guò)程，移植后7天血管生長(zhǎng)最旺盛，28天時(shí)基本完成血管的重建。 3.凍融過(guò)程對(duì)EGFR在卵巢組織中的分布和表達(dá)無(wú)明顯影響；EGFR在凍融胎兒卵巢組織的原始卵泡中有陽(yáng)性表達(dá)，且在異種移植后隨卵泡的發(fā)育EGFR陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明EGFR在卵泡發(fā)育的早期就參與了卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)。 4.外源性促性腺激素-PMSG能提高凍融胎兒卵巢組織異種移植后凍融胎兒卵巢組織內(nèi)卵泡的存活率，促進(jìn)移植