立枯絲核菌第45家族糖苷水解酶PAMP活性區(qū)段及位點(diǎn)的研究.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、玉米在我國國民經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用,在我國糧食和飼料作物及工業(yè)原料方面占有舉足輕重的地位。玉米紋枯病已成為生產(chǎn)中的主要病害,隨著高密度栽培和高氮的推廣應(yīng)用,該病害快速蔓延,在全國各地不同玉米產(chǎn)區(qū)產(chǎn)生不同程度的減產(chǎn),嚴(yán)重影響我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量。
  植物細(xì)胞壁是抵抗外界病原物入侵的天然屏障。植物病原真菌和細(xì)菌都能產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶,成為在植物細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞之間蔓延的主要致病因子,如纖維素酶和果膠酶等。近年來,人們?cè)絹碓?/p>

2、注意到在真菌與植物互作機(jī)制方面起作用的細(xì)胞壁降解酶。PAMP分子是病原微生物表面存在的一些保守分子,廣泛存在于微生物中。植物模式識(shí)別受體通過識(shí)別病原物模式分子來激活體內(nèi)信號(hào)途徑,誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)從而限制病原物的入侵。
  前期研究發(fā)現(xiàn),R. solani AG-1-IA融合群中具有PAMP活性的酶中有β-1,4-內(nèi)切纖維素酶EG1,EG1是一個(gè)PAMP分子,并且有研究證明了PAMP活性與催化活性相互獨(dú)立。為了進(jìn)一步確定其發(fā)揮作用的區(qū)段

3、及具體位點(diǎn),我們通過一系列實(shí)驗(yàn)來探究。
  我們將EG1的野生型命名為WT,通過基因定點(diǎn)突變將EG1氨基酸序列第32位的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)突變?yōu)楸彼幔ˋlanine,Ala),導(dǎo)致其催化活性的喪失并命名為D32A。為了確定EG1發(fā)揮PAMP活性的區(qū)段,我們對(duì)EG1的六個(gè)相對(duì)保守的區(qū)段進(jìn)行了突變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型WT突變區(qū)段C6后仍然具有較高的催化活力,能夠引起玉米、煙草等植物的葉片壞死,但是不能誘導(dǎo)PA

4、L、POD等防衛(wèi)反應(yīng)基因的過量表達(dá);D32A突變區(qū)段C6后幾乎沒有催化活性,既不能引起玉米、煙草等植物的葉片壞死,也不能誘導(dǎo)PAL、POD等防衛(wèi)反應(yīng)基因的過量表達(dá)。然后利用PVX表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先利用PCR擴(kuò)增法將信號(hào)肽序列插入基因5’末端,然后將片段插入pGR106空載體構(gòu)建PVX表達(dá)載體,而后經(jīng)過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101感受態(tài)細(xì)胞。將攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種煙草葉片,以

5、轉(zhuǎn)化空pGR106載體的農(nóng)桿菌作為對(duì)照(CK),結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT-C6可以使煙草葉片產(chǎn)生病斑,而D32A-C6則不可以。對(duì)于WT-C6和D32A-C6的不同表現(xiàn),我們認(rèn)為是其對(duì)細(xì)胞壁纖維素的降解所產(chǎn)生的效果。這些結(jié)果證明,C6保守區(qū)(序列為GCNWRFDWF)是EG1發(fā)揮PAMP活性的關(guān)鍵區(qū)段。
  接著,為了進(jìn)一步探究EG1的具體活性位點(diǎn),我們將C6區(qū)段內(nèi)的所有氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,并獲得相應(yīng)的突變工程菌和蛋白,將調(diào)整好濃度的純酶接種

6、玉米后發(fā)現(xiàn),其中一個(gè)蛋白R(shí)A不能引起玉米葉片的壞死。然后,用調(diào)整好濃度的RA的純酶接種玉米和煙草葉片,同時(shí)測(cè)定RA接種對(duì)玉米和煙草葉片活性氧產(chǎn)生的影響,以及對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RA不能使玉米和煙草葉片壞死,也不能使活性氧大量產(chǎn)生,同時(shí)不能引起防衛(wèi)反應(yīng)基因的過量表達(dá)。同時(shí)利用PVX表達(dá)載體對(duì)d32a-ra進(jìn)行表達(dá),發(fā)現(xiàn)攜帶pGR106/pd32a-ra的重組質(zhì)粒不能引起煙草葉片的壞死。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步確定了EG1的具體活性

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