1、血管并發(fā)癥是糖尿病(DM)的重要并發(fā)癥,嚴重影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量,給患者及社會帶來了沉重的負擔(dān),而且是糖尿病死亡的主要原因。血管內(nèi)皮細胞(endothelialeells,Ecs)是血液與血管平滑肌之間的生理屏障,其結(jié)構(gòu)和功能的完整對維持正常血液循環(huán)具有十分重要的意義。Ecs功能障礙會導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是來源于骨髓,在某些刺激

2、下動員進入外周血,分化為成熟的內(nèi)皮細胞,特定地歸巢于缺血部位,參與新生血管的發(fā)生,所以EPCs在維持血管平衡及代償性血管發(fā)生中必不可少。研究表明EPCs功能障礙是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要原因。心血管危險因素如性別、年齡、吸煙、高血壓、高脂血癥、DM、肥胖和家族史等可影響EPCs的數(shù)量及功能。
　　 目前,很多學(xué)者認為線粒體氧化應(yīng)激激活了亞細胞損傷途徑,是糖尿病及其血管并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。
　　 很多研究表明,E

3、cs功能異常發(fā)生于糖尿病發(fā)生之前。而糖尿病患者一級親屬(first degree relat ives,FDRs)及肥胖者是糖尿病的高危發(fā)病人群,我們推測,在這部分人群存在脂肪因子分泌異常、EPCs的改變及氧化應(yīng)激。
　　 本課題通過檢測糖耐量正常的2型糖尿病患者一級親屬以及肥胖者的血管內(nèi)皮功能、頸動脈內(nèi)中膜厚度、外周血EPCs數(shù)量,研究氧化應(yīng)激對EPCs水平的影響,探討糖尿病高危人群外周血EPCs改變的影響因素;研究營養(yǎng)性肥胖

4、大鼠骨髓源EPCs的改變及其抗氧化酶的表達以及氧化應(yīng)激水平,同時應(yīng)用高濃度葡萄糖對大鼠骨髓源EPCs進行培養(yǎng),誘發(fā)氧化應(yīng)激,并使用α硫辛酸(Alpha lipoic acid,ALA)進行干預(yù),觀察EPCs抗氧化酶的表達及功能的改變,探討糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機制及治療措施,為預(yù)防及治療糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。
　　 第一部分糖尿病高危人群血管內(nèi)皮功能、內(nèi)皮祖細胞水平與氧化應(yīng)激
　　 目的:探討糖耐量正常T2

5、DM一級親屬及肥胖者氧化應(yīng)激與血管內(nèi)皮功能及循環(huán)內(nèi)皮祖細胞水平的關(guān)系。
　　 方法:選擇32例T2DM,男18例,女14例,平均年齡(44.78±1.82)歲;FDRs30例男16例,女14例,平均年齡(46.87±1.91)歲,經(jīng)糖耐量試驗空腹及餐后2h血糖于正常范圍;肥胖組(oB)(BMI≧25kg/m2)31例,男16例,女15例,平均年齡(45.01±1.04)歲;正常對照組(NC)30例,男17例,女13例,年齡44.

6、07±1.89歲。每組均檢測身高、體重、血壓、腰圍、臀圍,計算體重指數(shù),測定空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、胰島素(FINs),計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。用流式細胞儀測定EPCs數(shù)量,多普勒超聲儀測定內(nèi)皮依賴性舒張功能(FMD)及頸動脈內(nèi)中膜厚度(CCA-IMT);化學(xué)比色法測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)及總抗氧化能力(TAO-C)。所有計量資料用均數(shù)

7、±標(biāo)準差((x)±s)表示,對所測定結(jié)果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。變量相關(guān)關(guān)系采用直線相關(guān)分析和多元直線回歸分析。
　　 結(jié)論:1.在2型糖尿病患者、2型糖尿病糖耐量正常一級親屬、肥胖者已經(jīng)存在胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量減少、血管內(nèi)皮功能受損及動脈硬化。2.氧化應(yīng)激是內(nèi)皮祖細胞數(shù)量減少、血管內(nèi)皮功能受損及動脈硬化的影響因素。3.在糖耐量正常2型糖尿病一級親屬,氧化應(yīng)激與胰島素抵抗可能是

8、糖尿病及其血管并發(fā)癥的始發(fā)因素。
　　 第二部分營養(yǎng)性肥胖大鼠氧化應(yīng)激與骨髓內(nèi)皮祖細胞水平的研究
　　 目的:應(yīng)用高脂飼料喂養(yǎng)建立營養(yǎng)性肥胖大鼠模型,分離培養(yǎng)并對骨髓EPCs進行計數(shù),同時測定肥胖大鼠血清氧化應(yīng)激水平,來進一步探討高脂飲食對大鼠骨髓源EPCs數(shù)量及功能改變并分析氧化應(yīng)激對它的影響。
　　 方法:1.清潔級健康雄性Wistar大鼠(體重200-250 g)23只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為正常對照組

9、(normal control group,NC)13只,高脂飲食組(high-fat-fed group,HF)10只。NC給予基礎(chǔ)飼料(熱量組成:碳水化合物占65.5％,脂肪占10.3％,蛋白質(zhì)占24.2％),總熱量為348kcal/100g;HF組喂以高脂飼料(熱量組成為脂肪60％,碳水化合物20％,蛋白質(zhì)20％),總熱量為502 kcal/100g。16周后測定Lee's指數(shù)、體重,判斷造模是否成功。2.造模成功后所有大鼠禁食1

10、0小時后均采用頸動脈插管抽血,分離血清,測定胰島素、血脂、ox-LDL等指標(biāo)。留取腎周、附睪周圍脂肪,稱重。3.將大鼠下肢骨從兩端截斷,用PBS反復(fù)沖洗骨髓腔,然后將離心管的沖洗液疊加于密度為1.081的大鼠淋巴細胞分離液上,2000轉(zhuǎn)/min,離心20min,用吸管吸出懸浮的中間細胞帶,置于另一15mL離心管中,加4倍體積的PBS,混勻后,1000轉(zhuǎn)/min,離心10min,棄去上清液后再用重復(fù)洗滌1次。末次離心后,棄上清,加入EGM

11、-2MY重懸細胞。接種到六孔板及24孔板中,接種密度為2×106個/mL。免疫細胞化學(xué)及多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定內(nèi)皮祖細胞。4.采集胸主動脈,用2.5％戊二醛固定,制備超薄切片進行透射電鏡觀察。5.所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件包進行分析。所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差((x)±s)表示,對所測定結(jié)果進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,計量資料兩組間比較采用t檢驗,P＜0.05為具有顯著性差異。變量相關(guān)關(guān)系采用直線相關(guān)分析和多元直線回歸分

12、析。
　　 結(jié)論:1.高脂喂養(yǎng)可導(dǎo)致肥胖、內(nèi)臟脂肪增加、胰島素抵抗。2.高脂喂養(yǎng)可導(dǎo)致大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞數(shù)量減少、血管內(nèi)皮細胞形態(tài)及功能改變。3.高脂喂養(yǎng)可導(dǎo)致大鼠血清SOD、GSH-Px、TAO-C水平減少、MDA水平增多,說明高脂飲食可導(dǎo)致大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激。4.在營養(yǎng)性肥胖大鼠,MDA是內(nèi)皮祖細胞水平的影響因素,說明氧化應(yīng)激影響大鼠骨髓源內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量和功能。
　　 第三部分高脂飲食對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞谷胱甘肽

13、過氧化物酶-1表達的影響
　　 目的:觀察高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠骨髓EPCs GPx-1的表達,探討高脂飲食對大鼠骨髓EPCs抗氧化能力的影響。
　　 方法:建立高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型(同第二部分),分離、培養(yǎng)并鑒定EPCs,應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)及Western-blot法測定EPCsGPx-1的mRNA及蛋白表達。
　　 結(jié)果:高脂飼料喂養(yǎng)16周后,與NC組比較,HF組大鼠骨髓GPx-1表達顯著減少(

14、P＜0.001)
　　 結(jié)論:高脂飲食可導(dǎo)致大鼠骨髓EPCs抗氧化應(yīng)激酶表達下調(diào)而使其抗氧化應(yīng)激能力減弱
　　 第四部分α-硫辛酸對高糖狀態(tài)下內(nèi)皮祖細胞功能的影響
　　 目的:應(yīng)用高濃度葡萄糖孵育EPCs,誘發(fā)氧化應(yīng)激,測定培養(yǎng)上清的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平,同時觀察EPCs的功能及GPx-1、eNOS的表達,然后應(yīng)用抗氧化劑ALA進行干預(yù),來探討葡萄糖引發(fā)EPCs損傷的機制及治療措施,為糖尿病血管

15、并發(fā)癥的預(yù)防及治療提供依據(jù)。
　　 方法:清潔級健康雄性Wistar大鼠(體重180-200 g)15只,分離培養(yǎng)EPCs,用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化培養(yǎng)4天的EPCs,分組貼壁24 h后分別給予葡萄糖5 mmol/L作為正常對照組(NC)、30 mmol/l葡萄糖作為高糖組(HS)以及葡萄糖(30 millol/l)+α硫辛酸(40μg/l)作為ALA組,孵育EPCs48小時,實時熒光定量PCR技術(shù)及Wester