1、研究背景:血管鈣化,在糖尿病和尿毒癥患者中十分常見(jiàn),與急性心肌梗死、血管順應(yīng)性下降、經(jīng)皮血管成形術(shù)時(shí)夾層形成有關(guān),血管鈣化也被認(rèn)為是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一[1,2]。鈣化的血管比正常血管更為僵硬,對(duì)血管舒張劑抵抗,更容易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和血栓形成,導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合癥等不良心血管事件的發(fā)生。心臟瓣膜部位發(fā)生鈣化,是導(dǎo)致瓣膜性心臟病(valvular heart disease,VHD)的重要原因,VHD與心力衰竭的發(fā)生高

2、度相關(guān),并且是預(yù)后不良的重要因素。既往認(rèn)為血管鈣化的發(fā)生是伴隨著年齡增加退行性變的鈣鹽被動(dòng)沉積的過(guò)程,但是最近的研究表明血管鈣化不是一個(gè)被動(dòng)的、血管疾病終末期、退行性變的表現(xiàn),而是一個(gè)主動(dòng)的受到精確調(diào)控的過(guò)程,和骨生成有很多相似的地方[3]。血管鈣化是在多種刺激因素下血管平滑肌細(xì)胞由收縮表型向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程[4]。
　　研究目的:高糖刺激可以引起VSMCs向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化,引起成骨樣細(xì)胞表型分子Cbfα-1和BGP

3、表達(dá)升高,ALP活性增加[5]。高糖和葡萄糖代謝產(chǎn)物葡萄糖胺可以引起血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,與動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR), UPR包括IRE-1、ATF6和PERK三條途徑[7]。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑在成骨細(xì)胞的發(fā)育成熟過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。VSMCs是如何向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制還未完全闡明,本實(shí)驗(yàn)旨在揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PERK途

4、徑是否在高糖誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　研究方法與結(jié)果:(1)原代培養(yǎng)的SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs,分為正常糖濃度組(5mmol/L D-葡萄糖),甘露醇滲透壓對(duì)照組(5mmol/L D-葡萄糖+25 mmol/L甘露醇),高糖組(30 mmol/L D-葡萄糖),高糖+PERK siRNA干預(yù)組(30 mmol/L D-葡萄糖+PERK siRNA轉(zhuǎn)染),高糖+RNA干擾陰性對(duì)照組(30 mmol/L

5、D-葡萄糖+Scramble RNA轉(zhuǎn)染)。分別作用48和72h。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2、ATF4的改變,以及成骨樣細(xì)胞標(biāo)志性分子-核心轉(zhuǎn)錄因子(Cbfα-1)、骨鈣素(BGP)以及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志性分子α-SMA的改變情況。應(yīng)用堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP的活性。(

6、2)與正常糖濃度和甘露醇滲透壓對(duì)照組相比,在mRNA水平,高糖組和高糖+RNA干擾陰性對(duì)照組 Cbfα-1、PERK、eIF2α、ATF-4表達(dá)升高(P<0.05),PERK-siRNA干預(yù)后其表達(dá)水平均降低(P<0.05),在蛋白質(zhì)水平, Cbfα-1、PERK、p-PERK、eIF2α、p- eIF2α、ATF-4表達(dá)升高(P<0.05), PERK-siRNA干預(yù)后其表達(dá)均降低(P<0.05)。高糖刺激VSMC后ALP活性升高(P