1、研究背景：
　　宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤，其病死率居女性癌癥病死率的第二位，是嚴重威脅婦女健康的主要疾病之一。研究證實，高危型人乳頭瘤病毒(hulnan papillomavirus，HPV)是導致宮頸癌的主要原因。幾乎所有的宮頸癌組織含有HPV，其中，HPV-16、HPV-18是最常見的型別。目前，宮頸癌的治療采用以手術和放射治療為主，同時輔以化療的綜合治療。因此，不可避免的會給患者，尤其是尚未生育的育齡婦女帶來巨大痛

2、苦。如何更加安全、有效地早期預防宮頸癌發(fā)生；在常規(guī)手術的基礎上，增加宮頸癌放、化療敏感性，成為當前研究的熱點與難點。因此探討宮頸癌的發(fā)生機制、尋找新的研究靶點、為腫瘤基因治療提供新思路無疑具有十分重要的意義。
　　宮頸癌的發(fā)生機制非常復雜，往往不是單一因素所導致的，普遍認為是多種致病因素共同作用的結(jié)果。許多研究結(jié)果表明，宮頸癌的發(fā)生與腫瘤抑制基因有密切關系。
　　p53是一種腫瘤抑制基因。在所有惡性腫瘤中，50％以上會出現(xiàn)該

3、基因的突變。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子。在正常細胞中，控制著細胞分裂周期、凋亡、DNA損傷修復。p53基因的突變通常會導致腫瘤細胞中p53蛋白的過度表達，已在許多腫瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)了抗p53抗體。文獻報道，宮頸癌中p53蛋白陽性率明顯高于正常宮頸組織，p53蛋白的陽性表達率與宮頸癌的組織分化程度密切相關，低分化者的p53蛋白表達高于高分化者，p53蛋白陽性者術后生存率低、生存期短。
　　目前已發(fā)現(xiàn)一些小分子和肽能夠恢復p

4、53突變體的功能，增強腫瘤細胞的凋亡敏感性。許多因子和蛋白都能影響p53的活性，發(fā)揮其促凋亡的功能。因此，需要探明更多的p53相關分子，及其在調(diào)節(jié)p53腫瘤抑制功能中的作用。p53的調(diào)節(jié)非常復雜，主要發(fā)生在翻譯后水平。而翻譯又有起始、延長、終止三個階段。大多數(shù)p53的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在翻譯起始階段。這個過程中最重要的就是翻譯起始因子eIF-2在α亞基的磷酸化。而eIF-2α的磷酸化是由eIF-2α激酶家族調(diào)控的。PKR就是eIF-2α激酶家

5、族中的一員。病毒感染復制產(chǎn)生的dsRNA能夠激活PKR，進而磷酸化其底物eIF-2α，磷酸化的eIF-2α抑制蛋白質(zhì)合成，包括病毒蛋白的合成，誘導被感染細胞凋亡，在控制病毒復制中起著非常重要的作用。
　　研究目的：
　　1.從細胞水平明確宮頸癌細胞系Hela中，活化的PKR對p53的影響；
　　2.初步探討Hela細胞中，激活PKR影響p53的機制。
　　研究方法：
　　1.激活PKR后，利用western

6、 blot檢測Hela細胞中p53及PKR下游主要作用產(chǎn)物的水平。
　　2.利用免疫熒光染色法檢測Hela細胞中p53的表達情況，明確在Hela細胞中PKR與p53的關系。
　　3.使用RNA干擾的手段對Hela細胞中PKR基因?qū)嵤┨禺愋砸种?，并通過western blot方法檢測其抑制效率。
　　4.利用salubrinal抑制eIF-2α去磷酸化后，利用western blot和免疫熒光染色檢測Hela細胞中PKR

7、影響p53與eIF-2α磷酸化的關系。
　　研究結(jié)果：
　　1.dsRNA類似物polyIC能夠促p53降解、胞漿移位。同時使eIF-2α磷酸化增多；
　　2.Hela細胞中p53主要位于胞核中，胞漿中也有。
　　3.MG132預處理細胞可明顯抑制p53降解及向胞漿移位。
　　4.成功構建PKR的siRNA片段，并通過western-blotting證實了PKR的蛋白表達水平下降，綜合說明構建的常規(guī)siRN

8、A片段有明顯抑制PKR蛋白表達的效果；
　　5.polyIC活化PKR，PKR使其作用底物eIF-2α磷酸化、p53降解；
　　6.salubrinal能夠明顯抑制eIF-2α去磷酸化。eIF-2α磷酸化狀態(tài)增多，但是p53蛋白含量并沒有降低，p53也沒有向胞漿移位。
　　結(jié)論：
　　1.宮頸癌Hela細胞中，dsRNA激活PKR，促p53降解、核輸出。當利用siRNA沉默PKR后，p53不降解，沒有發(fā)生核輸出。

9、說明在宮頸癌Hela細胞中，PKR對p53的穩(wěn)定性起著負調(diào)節(jié)作用。但是在DAN損傷時，PKR被激活，又能促p53穩(wěn)定。因此，在宮頸癌Hela細胞中PKR調(diào)節(jié)p53的能力可能與HPV感染有關。
　　2.雖然eIF-2α磷酸化在調(diào)節(jié)基因水平表達，終止翻譯起始階段非常重要，但在Hela細胞中，活化PKR促p53降解卻不需要eIF-2α磷酸化。這說明在宮頸癌Hela細胞中，dsRNA激活PKR是通過其他途徑對p53起作用的。
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