1、本研究參照GenBank收錄的綿羊凝乳酶原前體cDNA序列(GenBank No：X53037)設計RT-PCR、PCR與巢式引物，以新生5天的西農薩能羊公羔羊為研究對象，利用手術法采集羔羊皺胃組織，利用Trizol法提取皺胃組織總RNA，經過電泳鑒定后，以總RNA為模板利用RT-PCR方法獲得西農薩能羊凝乳酶原前體cDNA序列，以cDNA序列為模板進行擴增和T載體連接測序。利用軟件NCBI BLASTn、BLASTp與ClustalW

2、對該基因的測序結果進行序列比對、進化樹分析；利用軟件Compute pI/MW、MLRC、SignalP V3.0分別分析該基因的物理性質、二級結構與折疊類型、信號肽剪切位點；利用軟件Feature Map3D、SWISS-MODE分析該基因的三級結構與活性中心位點。根據測序結果設計引物，利用酵母整合質粒載體pPICZα A構建重組質粒，電擊轉化法將重組質粒整合至巴斯德畢赤酵母基因組DNA，篩選鑒定凝乳酶原重組轉化子。獲得以下研究結果：

3、 1.克隆了西農薩能羊凝乳酶原前體基因Cdna序列，全長1292bp，編碼381個氨基酸，該基因Cdna序列登錄GenBank(GenBank No：EFl99763)。序列分析表明，西農薩能羊凝乳酶原前體基因與山羊、牛、綿羊、狷羚、駱駝、狗、人、豬、恒河猴、兔子凝乳酶原的核苷酸同源性分別為99.41％、98.74％、95.29％、95.81％、87.48％、83.69％、81.91％、67.43％、66.74％、66.39％，

4、氨基酸同源性分別為99.21％、98.42％、93.70％、93.42％、83.99％、74.09％、57.22％、56.37％、57.18％、54.18％。 2.物理性質分析表明，西農薩能羊凝乳酶原的分子量為大約為42.1kDa，成熟凝乳酶的分子量為35.5kDa，等電點為4.45。 3.通過對凝乳酶原前體基因二級結構與折疊類型的分析表明，α螺旋短片段約占總氨基酸的8.36％，β折疊約占總氨基酸的32.82％，α螺旋短

5、片在1-175氨基酸殘基組成的N端區(qū)域和176-323氨基酸殘基組成的C端區(qū)域無相同的片段。 4.凝乳酶原前體蛋白存在一個16個氨基酸的信號肽序列，信號肽剪切位點分析表明，西農薩能羊凝乳酶原基因的信號肽剪切位點位于，Met16-Gly17之間。 5.三級結構分析表明：本研究克隆出的凝乳酶原前體基因形成的成熟凝乳酶在244位點為甘氨酸，為B型凝乳酶。兩個天冬氨基酸活性位點：Asp32和Asp215，維持活性中心三維構象的氨

6、基酸Thr33、Ser35、Thr216、Thr218、NHGly217和NHGly34，二硫鍵：Cys45-Cys50，Cys206-Cys210和Cys250-Cys283均無變異，能夠形成正確的二裂片三維構象。 6．利用設計的引物和酵母分泌型表達載體pPICZαA成功構建了西農薩能羊凝乳酶原前體基因的非融合蛋白和融合蛋白重組表達載體Ppicz—T1、Ppicz—T2，電擊轉化巴斯德畢赤酵母后，成功將重組西農薩能羊凝乳酶原前