1、背景與目的： 盡管急性白血病的治療效果近年來有了較明顯的提高，但仍然有15～30％的病人發(fā)生原發(fā)性耐藥，60～80％的患者完全緩解后因繼發(fā)性耐藥復發(fā)而死亡[1]。隨著生物學技術快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)真核細胞內蛋白質降解大部分是通過泛素一蛋白酶體通路(Ubiquitin-ProteasePathway，UPP)完成，人白血病細胞含有異常高水平的蛋白酶體活性，且在誘導終末白血病細胞分化時蛋白酶體迅速被下調，表明蛋白酶體的活性與白血病細胞

2、的惡性增殖有著密切相關性，因此蛋白酶體可能成為白血病治療的新靶點[2]。 目前研究證實，蛋白酶體在細胞內蛋白降解、MHC-I類抗原遞呈、細胞內部錯誤折疊蛋白的修復上發(fā)揮著重要的功能，多種與細胞周期調控、信號轉導、細胞凋亡相關的蛋白的正常代謝，都與其功能的正確執(zhí)行密切相關。特異性阻斷蛋白酶體功能顯著改變以上蛋白在細胞內的表達水平，導致細胞內蛋白質代謝發(fā)生紊亂，從而誘導細胞發(fā)生凋亡，是目前認識的蛋白酶體抑制劑主要的抗腫瘤作用機制[3

3、]。 硼替佐米(Bortezomib)是第一個被美國FDA批準用于臨床的蛋白酶體抑制劑，唯一的適應癥是難治、復發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)的治療[4]。此外，初步的多項臨床試驗表明硼替佐米單獨或聯(lián)合其他藥物治療非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、成人T細胞白血病、肺癌、卵巢癌等也具有良好效果[5]。有關硼替佐米治療急性髓系白血病的研究至今很少報道，我們前期工作中發(fā)現(xiàn)硼替佐米體外能夠抑制急性髓系白血

4、病細胞株HL60的增殖并誘導其凋亡，與三尖杉酯堿(HT)或三氧化二砷(AS2O3)聯(lián)合后作用明顯增強[6-9]，但它們對產生多藥耐藥的急性髓系白血病細胞的作用如何至今尚缺乏報道，此乃是本研究立題的主要動機。 研究方法： 首先選擇急性髓系白血病多藥耐藥細胞株HL60／ADM為研究對象。應用MTT法比較HL60／ADM和HL60細胞之間對阿霉素殺傷作用的敏感性。以耐藥倍數(shù)大于30倍定義為耐藥，此后將HL60／ADM細胞培養(yǎng)于

5、含有10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。經過預實驗在0～1000nM之間篩選硼替佐米對HL60／ADM細胞作用的最佳濃度，在0～72h之間選擇處理的最佳時間，在0～752nM之間確定HT的IC50濃度，在0～4μM之間確定AS2O3的IC50濃度，依據臺盼藍拒染法確定各實驗組處理后細胞存活情況。 確定硼替佐米0～50nM為后續(xù)實驗濃度，作用48h為最佳處理時間。硼替佐米的IC50濃度約為20nM，HT的IC50濃

6、度為752nM，AS2O3的IC50濃度為15μM。在上述預實驗的基礎上，將HL60／ADM細胞分為硼替佐米、As2O3或HT單藥處理組、硼替佐米聯(lián)合AS2O3處理組和硼替佐米聯(lián)合HT處理組，每組處理的細胞數(shù)一致，每組均設置空白對照組。各組檢測指標相同，即用MTT法檢測細胞增殖、應用AnnexinV-FITC／PI染色流式細胞術和Hoechst33342染色檢測細胞凋亡，并應用流式細胞儀檢測HL60／ADM細胞攝取阿霉素的情況。

7、 在完成上述實驗研究之后，選擇9例復發(fā)、難治性急性髓系白血病患者原代細胞應用MTT法研究其增殖變化。硼替佐米不同濃度間增殖活性差異采用單因素方差分析；硼替佐米聯(lián)合HT或AS2O3對HL60／ADM白血病細胞增殖活性影響比較使用析因分析；細胞凋亡改變采用方差分析，兩兩比較采用LSD法；阿霉素陽性率比較采用兩樣本t檢驗。藥物聯(lián)合后對原代細胞的細胞活性差異采用隨機區(qū)組方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗。 結論： 1、硼替佐米單

8、藥對HL60／ADM多藥耐藥細胞具有抑制增殖及誘導凋亡的作用，其效果呈時間-劑量依賴性，隨著時間的延長和劑量的增加作用顯著增強。 2、三尖杉酯堿和三氧化二砷對HL60／ADM多藥耐藥細胞均具有抑制增殖作用，效果呈劑量依賴性，各自的IC50劑量下分別與不同濃度硼替佐米聯(lián)合處理后，與硼替佐米單藥處理組相比，其抑制增殖和誘導凋亡作用明顯增強。 3、硼替佐米能夠促進HL60／ADM細胞對阿霉素的攝取，提高細胞內阿霉素濃度，從而降