1、在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，高等植物為了抵抗昆蟲的侵害，建立起了復(fù)雜、多樣的抗性反應(yīng)機(jī)制。從總體上講，植物對(duì)昆蟲的抗性可分為組成型抗性和誘導(dǎo)型抗性兩種類型。所謂誘導(dǎo)型抗性是指植物受到昆蟲侵害后，迅速合成一系列對(duì)昆蟲有毒性的化學(xué)物質(zhì)而對(duì)昆蟲的進(jìn)食、消化吸收、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用，從而達(dá)到抗蟲的目的。誘導(dǎo)型抗性是植物自身所產(chǎn)生的一種更為主動(dòng)、更為經(jīng)濟(jì)有效的抗性反應(yīng)方式，具有重要的理論研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。深入認(rèn)識(shí)植物對(duì)昆蟲抗性的分子機(jī)

2、理將會(huì)為利用植物自身的抗性建立環(huán)境友好的控制農(nóng)業(yè)害蟲的策略提供理論依據(jù)。這一策略是我國(guó)乃至世界農(nóng)業(yè)的迫切要求和發(fā)展趨勢(shì)。要達(dá)到這一目標(biāo)，就必須對(duì)植物自身的抗性反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行深入透徹的研究。 就植物對(duì)昆蟲抗性反應(yīng)機(jī)理而言，番茄被認(rèn)為是研究植物從受傷刺激到抗性基因表達(dá)這一信號(hào)傳導(dǎo)過程的最理想的模式系統(tǒng)。這主要是因?yàn)榉阎写嬖诤饬靠剐苑磻?yīng)強(qiáng)弱的標(biāo)志蛋白——蛋白酶抑制劑(Proteinaseinhibitors，PIs)。蛋白酶抑制劑是一

3、類富含絲氨酸的小分子量堿性蛋白質(zhì)分子，通過抑制昆蟲體內(nèi)消化酶的活性而達(dá)到抗蟲的目的。 本實(shí)驗(yàn)室以前人多年的研究工作為基礎(chǔ)，以番茄為模式系統(tǒng)，利用抗蟲機(jī)理研究透徹的PIs作為衡量抗性強(qiáng)弱的生化標(biāo)記來篩選番茄抗性缺失突變體，從而建立了用正向遺傳學(xué)的思路和方法解析植物對(duì)昆蟲抗性反應(yīng)機(jī)制的研究體系。前期工作證明植物激素茉莉酸作為一種可以長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)的信號(hào)分子在植物對(duì)昆蟲侵害的系統(tǒng)性抗性中起核心調(diào)控作用。為了獲得在這一系統(tǒng)素/茉莉酸信號(hào)途徑

4、中更多的新組分，本研究對(duì)原有的遺傳篩選體系從基礎(chǔ)材料和篩選指標(biāo)兩方面進(jìn)行了改進(jìn)，使之適合從全基因組范圍內(nèi)大規(guī)模鑒定番茄抗性缺失突變體。以組成型表達(dá)PIs的轉(zhuǎn)基因番茄35S．:PS為基礎(chǔ)材料，利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)進(jìn)行化學(xué)誘變，采用多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)染色與PIs鑒定相結(jié)合的方法篩選番茄抗性缺失突變體，從而大大提高了遺傳篩選的效率。 本研究中的

5、spr6是新獲得的番茄抗性缺失突變體，機(jī)械受傷和外施系統(tǒng)素不能誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑ⅡⅢ(PI-Ⅱ)的表達(dá)，但茉莉酸能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)PI-Ⅱ的表達(dá)，這意味著該突變體在番茄傷害信號(hào)途徑中起到重要作用，并且該突變體可能是一類茉莉酸合成突變體；將該突變體spr6和抑制的茉莉酸合成突變體雜交結(jié)果顯示，spr6和所有已知的合成突變體(defl、spr2和acxl/JLl)都不等位。我們由此推斷該突變體spr6編碼一個(gè)與茉莉酸合成或者合成調(diào)控有關(guān)

6、的新基因。為了驗(yàn)證突變是否影響了JA的合成，我們對(duì)spr6中JA含量通過GC-MS測(cè)定，在未受傷的突變體和野生型番茄中JA含量分別為85±21ng(g FW)<'-1>和95±34ng(gFW)<'-1>；受傷處理后兩者的JA含量分別為360±22ng(g FW)<'-1>和460±36ng(g FW)<'-1>。突變體中的JA含量大約是野生型中的78％。這說明突變并沒有影響JA的基礎(chǔ)含量，但是部分破壞了受傷誘導(dǎo)的JA的積累。遺傳學(xué)研究

7、證明，在spr6的F2分離群體中對(duì)其單株P(guān)I-Ⅱ積累水平進(jìn)行分析，有受傷反應(yīng)的單株和沒有反應(yīng)的單株分別為89株和34株，符合3：1的分離比(x<'2>=1.11)，這說明spr6受傷誘導(dǎo)的PI-Ⅱ表達(dá)的缺失是由單隱性基因突變?cè)斐傻?。利用圖位克隆技術(shù)將相應(yīng)基因印Spr6定位在第5號(hào)染色體IL5-3相應(yīng)區(qū)段，通過候選基因法策略證明Spr6基因是LeCOll基因單堿基突變形成的一個(gè)等位基因。通過RT-PCR得到spr6純合系和野生型番茄WT的

8、LeCOll全長(zhǎng)cDNA。DNA序列測(cè)定和比對(duì)顯示，Spr6基因是在LeCOll基因的編碼區(qū)第1254個(gè)堿基位置發(fā)生了G<,1254>→T的單堿基替換所致。這一突變?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上表現(xiàn)為該位置相應(yīng)的第418個(gè)氨基酸Leu<,418>(亮氨酸)替換為Phe(苯丙氨酸)。spr6突變體育性正常為研究茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)提供了一個(gè)非常有價(jià)值的工具。 本研究中Spr6基因的快速分離證明了基于遺傳連鎖分析的候選基因法策略的成功，而且隨著更多的系統(tǒng)