1、目的：納米顆粒具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物特性，越來越廣泛地被應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個(gè)領(lǐng)域中。它們在這些領(lǐng)域的應(yīng)用帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，但同時(shí)也產(chǎn)生潛在的生物安全性與環(huán)境安全性等問題而引起世界范圍的廣泛關(guān)注。心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的重大疾病，而空氣細(xì)微顆粒物與心血管疾病之間的密切關(guān)系已得到證實(shí)，有研究表明碳納米顆粒進(jìn)入肺部后能轉(zhuǎn)移到心血管系統(tǒng)，因此納米顆粒的心血管毒性格外引入注目。一些研究結(jié)果顯示納米顆?？梢鹨幌盗信c細(xì)胞代謝、凋

2、亡、細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的mRNA水平的改變。其損傷機(jī)制尚無定論，目前研究較多的是氧化應(yīng)激機(jī)制。血管內(nèi)皮細(xì)胞為覆蓋于血管內(nèi)膜表面的單層扁平或多角形的細(xì)胞，它的損傷與功能紊亂和多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系。因此，研究目前應(yīng)用最多的納米材料之一，多壁碳納米管(MWCNTs)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及其機(jī)制，對(duì)了解納米材料在心血管疾病方面的潛在危害有著積極的意義。本實(shí)驗(yàn)采用體外實(shí)驗(yàn)探索MWCNTs引起血管細(xì)胞

3、的損傷作用及其機(jī)制。觀察MWCNTs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)細(xì)胞活力、DNA損傷作用、ROS水平、過氧化反應(yīng)和炎癥因子分泌的影響。為了模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，將HUVECs和人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，觀察MWCNTs對(duì)HUVECs的毒性作用，為評(píng)價(jià)MWCNTs的潛在心血管毒性及其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴用臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察不同濃度(0.2、1、2、5、10、20、50、100μg/ml)的MWCNTs對(duì)

4、HUVECs的存活率的影響，設(shè)定本實(shí)驗(yàn)的劑量范圍；用倒置顯微鏡觀察MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞形態(tài)變化；用透射電鏡觀察MWCNTs(20μg/ml)處理后HUVECs24h細(xì)胞吞噬MWCNTs的情況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；用檢測細(xì)胞凋亡的試劑盒檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞凋亡的情況；用免疫熒光法觀察MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞中磷酸

5、化組蛋白H2AX(yH2AX)焦點(diǎn)形成情況，比較細(xì)胞核內(nèi)焦點(diǎn)形成的數(shù)量及熒光強(qiáng)度。免疫熒光顯微鏡圖片用Image Pro Plus軟件進(jìn)行yH2AX焦點(diǎn)定量計(jì)數(shù)。⑵用DCFH-DA法檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況；用硫代巴比妥酸法(TBA法)測定細(xì)胞內(nèi)MDA的含量、黃嘌呤氧化酶法測SOD活力，通過還原型谷胱甘肽(GSH)的消耗量來測定GSH-Px活力。⑶用酶聯(lián)免疫試劑盒(ELI

6、SA)檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α的變化。⑷NAC(6 mM)預(yù)處理后，1)用試劑盒檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞凋亡的情況。2)用DCFH-DA法檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞內(nèi)的ROS水平變化。3)用免疫熒光技術(shù)檢測MWCNTs(5vg/ml)處理后HUVECs細(xì)胞yH2AX焦點(diǎn)形成情況，與N

7、AC預(yù)處理前進(jìn)行比較。⑸將HUVECs與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，用DCFH-DA法檢測MWCNTs(0.5、5、20μg/ml)處理共培養(yǎng)細(xì)胞系后HUVECs內(nèi)的ROS水平變化。與未共培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果比較。⑹所有結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　 結(jié)果：①0、0.5、2、5、10、20μg/ml MWCNTs作用下，HUVECs細(xì)胞的存活率均在70％以上，隨著染毒濃度的增高，細(xì)胞存活率下降，并存在劑量和時(shí)間依賴關(guān)系；正常HUVEC

8、s細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈連續(xù)分布，互不重疊，細(xì)胞形狀規(guī)則，呈典型鋪路石狀排列。隨著MWCNTs濃度增加，死亡懸浮細(xì)胞增多，且細(xì)胞形態(tài)改變明顯。透射電鏡顯示20μg/ml染毒組細(xì)胞胞漿中空泡狀結(jié)構(gòu)增多，并吞噬有MWCNTs，細(xì)胞核不規(guī)則，出現(xiàn)核皺縮；MWCNTs作用24h后，各濃度的MWCNTs都促進(jìn)了HUVECs細(xì)胞的凋亡，與對(duì)照組比較有顯著性差異；免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組中大部分(>80％)細(xì)胞核內(nèi)無yH2AX的存在，只有少數(shù)細(xì)胞核

9、內(nèi)可發(fā)現(xiàn)少許yH2AX。各劑量MWCNTs處理細(xì)胞后，均可引起細(xì)胞核內(nèi)yH2AX焦點(diǎn)形成，并有劑量依賴性。與空白對(duì)照組相比有顯著性差異。②細(xì)胞內(nèi)的ROS水平隨著MWCNTs濃度升高而升高。20μg/ml MWCNTs能引起細(xì)胞ROS水平的顯著增高，且有時(shí)間依賴關(guān)系；隨著MWCNTs濃度的增高，HUVECs細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著增加，其中5、20μg/ml組與對(duì)照組比較有顯著性差異。當(dāng)MWCNTs濃度較低時(shí)(0.5、5μg/ml)，細(xì)胞內(nèi)G

10、SH-Px增加，與對(duì)照組比較有顯著性差異，而當(dāng)MWCNTs濃度升高到20μg/ml時(shí)GSH-Px又降低。SOD的變化與GSH-Px的變化相似。③MWCNTs對(duì)HUVECs細(xì)胞炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生沒有明顯的影響。④經(jīng)6 mM NAC預(yù)處理后，1)細(xì)胞凋亡率與未處理的染毒組相比均有降低，其中0.5μg/ml劑量組與同劑量單純MWCNTs處理組相比具有顯著性差異。2)與單純MWCNTs處理組相比，形成γH2AX焦點(diǎn)的陽性細(xì)胞明顯減少，具有

11、顯著性差異(p<0.01)。3)細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低，其中5、20μg/ml劑量組與同劑量單純MWCNTs處理組相比具有顯著性差異。⑤HUVECs與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，HUVECs中的ROS含量均比未共培養(yǎng)時(shí)的ROS含量增加，20μg/ml組有顯著差異。
　　 結(jié)論：MWCNTs能進(jìn)入HUVECs細(xì)胞，降低細(xì)胞的存活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和DNA損傷，并伴有ROS水平升高和細(xì)胞氧化還原失衡。提示MWCNTs誘導(dǎo)HUVECs損傷