1、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）是重要的海水養(yǎng)殖動物病原菌，廣泛生存于各種不同的海洋環(huán)境中。海洋細菌具有多種適應海洋環(huán)境的策略，而鰻弧菌適應海洋生態(tài)環(huán)境的機制研究不多。細菌的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)是一種新的蛋白分泌系統(tǒng)，在許多海洋細菌的致病性和環(huán)境適應性方面發(fā)揮重要作用。本文開展了鰻弧菌MHK3株T6SS的表達及其介導的抑菌作用的研究，旨在深入了解鰻弧菌的生態(tài)適應機制。主要的研究內容和結果如下:
　　1.不同培養(yǎng)條

2、件對鰻弧菌MHK3 T6SS表達和分泌功能的影響。Hcp（溶血素共調蛋白）是依賴T6SS分泌的一個基質蛋白，有T6SS的細菌能夠將Hcp分泌到細菌外是T6SS具有功能的一個重要特征。在實驗室適宜培養(yǎng)條件下，鰻弧菌MHK3的T6SS具有分泌Hcp的功能。本研究利用qRT-PCR和Western bolt方法，分析MHK3在各種溫度(10℃、16℃、28℃、37℃)、鹽度(0.2％、0.5％、1.0％、3.0％、5.0％NaCl)和pH(6

3、、7、8、9、10)條件下表達和分泌Hcp的特征。結果顯示，Hcp在10-37℃培養(yǎng)時均可表達和分泌，在轉錄水平上，Hcp mRNA表達量隨溫度升高而降低，在10℃的表達量最高;在蛋白水平上，胞內Hcp蛋白量在10-37℃變化不大，而胞外Hcp蛋白量在10-28℃較高，在37℃較低。Hcp在0.2-5％NaCl均有表達和分泌，在轉錄水平上，Hcp mRNA表達量在3％NaCl條件下最高，在其它鹽度條件下的表達量均較低;在蛋白水平上，胞內

4、和胞外Hcp蛋白量在0.5-5％NaCl均較高，在0.2％NaCl條件下較低。Hcp在pH6-10均有表達，在轉錄水平上，Hcp mRNA表達量在pH8時最高;在蛋白水平上，胞內和胞外的Hcp蛋白量隨pH提高而減少，在pH10時MHK3不分泌Hcp。蛋白穩(wěn)定性實驗結果顯示，分泌到胞外的Hcp蛋白8h內保持穩(wěn)定而不降解。上述結果表明，在海洋環(huán)境的物理因子變化較劇烈的條件下，鰻弧菌依然能夠表達和分泌Hcp，發(fā)揮T6SS的分泌功能。
　

5、　2.密度感應系統(tǒng)調節(jié)基因luxO對MHK3 T6SS表達和分泌的影響。構建了MHK3 luxO基因的缺失突變株（ΔluxO），研究發(fā)現(xiàn)在實驗室培養(yǎng)條件下ΔluxO的生長速率變慢。通過qRT-PCR和Western blot比較分析MHK3野生株及突變株ΔluxO、ΔvasC（MHK3 T6SS結構基因vasC的缺失株）在不同生長時期（OD540nm=0.1、0.6、1.0、2.0）Hcp的表達和分泌。結果顯示，與野生株MHK3相比，在

6、整個生長期ΔluxO和ΔvasC的Hcp mRNA轉錄水平很低，ΔluxO的胞內和胞外沒有檢測到Hcp蛋白，而僅在ΔvasC胞內能檢測到Hcp蛋白。這些結果說明，luxO基因在轉錄水平上影響hcp基因的表達;vasC基因的缺失導致T6SS結構不完整，影響Hcp分泌到細胞外。
　　3.鰻弧菌MHK3 T6SS介導的抑菌作用。分別建立野生株MHK3（T6SS具有分泌Hcp的功能，Hcp+）及其突變株ΔluxO(T6SS沒有分泌Hcp的

7、功能，Hcp)、ΔvasC(Hcp)與大腸桿菌(Escherichia coli)和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的共培養(yǎng)體系，相互作用4h后進行細菌計數(shù)。結果顯示，在MHK3(Hcp+)與E.coli(Hcp-)或E.tarda(Hcp-)的共培養(yǎng)體系，MHK3(Hcp+)的數(shù)量沒有明顯變化，而E.coli(Hcp-)或E.tarda(Hcp-)的細菌數(shù)量下降2-3 logs;在ΔluxO(Hcp-)或Δvas