1、細胞移植是近年眾多領域的研究熱點，肝臟干細胞移植經(jīng)過30多年的發(fā)展，已由動物實驗向臨床過渡。初步結(jié)果顯示，來自于骨髓的干細胞，在體內(nèi)與體外均能分化為功能完備的肝細胞，細胞移植在急慢性肝衰竭和遺傳代謝性肝病方面具有很好的前景。用骨髓干細胞替代成熟肝細胞進行移植，有望使細胞移植在肝病治療方面取得重大突破。但移植細胞的活體示蹤以及進一步的療效觀察卻一直是面臨的難題。Weissleder于1999年提出分子影像學(molecularimagin

2、g,MI)概念后，分子影像學已經(jīng)成為影像醫(yī)學和相關臨床醫(yī)學的研究熱點。研究者采用氧化鐵顆粒標記移植細胞進行了廣泛的磁共振(MRI)活體示蹤研究。國內(nèi)的相關實驗研究也開始起步。本實驗采用超順磁性氧化鐵(superparamagneticironoxide，SPIO)(德國Schering公司)實施體外標記，進行干細胞MR成像以及活體肝臟移植細胞的MR示蹤研究，探討標記干細胞體外成像的要素，及標記干細胞在正常肝臟的成像特點和代謝規(guī)律等，為采

3、用細胞移植技術治療肝功能衰竭，提供實驗研究依據(jù)。 目的探討SPIO標記兔骨髓干細胞的方法、濃度、細胞量以及不同標記濃度對細胞分裂增殖、貼壁、遷移能力的影響；探討標記細胞的體外磁共振成像及其特點；探討標記干細胞肝內(nèi)植入后磁共振成像特點和衰減規(guī)律。 方法選擇體重1.5～2.0kg成年家兔20只。穿刺髂骨，抽取骨髓，分離培養(yǎng)兔骨髓干細胞。在細胞培養(yǎng)液中加入HGF和bFGF誘導細胞在體外增殖、分化。利用干細胞的吞噬能力，在培養(yǎng)液

4、中加入不同濃度的SPIO標記干細胞，觀察、對比不同標記濃度對細胞生物學活性的影響。在標記后的適當時間，將細胞懸浮于Ependoff管內(nèi)行MR掃描。將適當濃度SPIO標記的干細胞，在B超引導下穿刺注入同體家兔的肝臟內(nèi)。在注射后1天、3天、1周、2周以及1月等不同時間，對家兔肝臟行T1W、T2W、TFE序列的磁共振掃描，動態(tài)觀察直至信號消失。取肝臟標本行HE和普魯士蘭染色，觀察移植細胞在肝內(nèi)的遷徙。 結(jié)果1.BMSC的原代培養(yǎng)：骨髓

5、干細胞懸液接種后24h開始有細胞貼壁。72h完全換液后可見貼壁細胞分裂增殖。培養(yǎng)5～7d后細胞分裂增殖明顯，出現(xiàn)形態(tài)均一的細胞增殖集落，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，約8～12d后貼壁生長的細胞即可融合形成單層結(jié)構(gòu)。 2.BMSC的體外標記觀察及標記率測定：孵化過夜后，倒置顯微鏡觀察所有細胞，見胞漿內(nèi)有或多或少的黑色鐵顆粒，標記率接近100％。 3.四甲基偶氮唑蘭(MTT)比色法檢測細胞的增殖能力，得出細胞生長曲線圖，證實用35u

6、gFe/ml濃度的SPIO標記的細胞，具有與未標記細胞一樣的增殖能力。 4.標記后的BMSC體外MRI成像顯示，在T1W、T2W、和TFE序列均可見信號改變，以T2WI和TFE較明顯。 5.細胞移植后MRI活體內(nèi)示蹤：正常對照組1未標記的骨髓干細胞注入肝臟左葉后MRI均未顯示；正常對照組2注射單純SPIO后24h內(nèi)均可顯示低信號團，但24h后則顯示不明顯，30h后完全不顯示；標記高濃度SPIO的干細胞注射組，在T1WI、

7、T2WI和TFE等MRI圖像上，肝臟左葉標記細胞注射區(qū)域出現(xiàn)信號減低，以TFE信號減低最為顯著且有靶區(qū)面積增大效應(磁敏感效應)。同時間點不同序列靶區(qū)信號降低程度不盡相同，即TFE＞T2WI＞T1WI。不同時間點同一序列靶區(qū)逐漸變小，在T1WI和T2WI的改變較為一致，而TFE的靶區(qū)減小緩慢。無論T1WI圖像，還是T2WI圖像和TFE圖像均顯示，注射標有SPIO干細胞后，隨著時間的延長直到術后30d，靶區(qū)信號強度與術前相比均有顯著性的變

8、化(P＜0.01)，而且在術后50d，注射部位仍可見低信號區(qū)域。 結(jié)論1.Ficoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可以用來分離家兔的BMSC，獲得單核的細胞純度和存活率較高，細胞的功能保持的較好。以1×106/ml的細胞濃度接種培養(yǎng)可獲得良好的細胞分化和增殖。 2.用35ugFe/ml的SPIO培養(yǎng)液標記BMSC，可獲得理想的標記率而且細胞的增殖能力不受影響。1×105/ml以上的標記細胞濃度可獲得理想的MR信號強度。