1、5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)是催化花生四烯酸生成白三烯(leukotrienes，LTs)的關(guān)鍵酶。LTs是一類很強的炎癥介質(zhì)，包括白三烯B4(LTB4)以及半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括LTC4，LTD4，LTE4)。CysLTs通過激活半胱氨酰白三烯受體(包括CysLT1和CysLT2受體)，參與多種炎癥病理過程，介導(dǎo)平滑肌痙攣、微血管滲漏等反應(yīng)。早期，5-L

2、OX、CysLT1和CysLT2受體主要在外周細胞和組織被發(fā)現(xiàn)，因此對它們的研究也主要集中在呼吸系統(tǒng)等外周疾病。近幾年來的研究表明，5-LOX、CysLT1和CysLT2受體也在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達，可能參與腦缺血、腦外傷、腦腫瘤和腦退行性疾病等中樞疾病。腦缺血后，腦內(nèi)5-LOX表達增加、活性增高，其代謝產(chǎn)物CysLTs顯著增加；CysLT1和CysLT2受體也表達增加或被誘導(dǎo)表達。5-LOX抑制劑，如AA861、MK-886和愈創(chuàng)木酸(n

3、ordihydroguaiareticacid，NDGA)，對實驗動物的腦缺血性損傷有保護作用；本實驗室也發(fā)現(xiàn)，CysLT1受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特可保護實驗動物的腦缺血性損傷。然而，5-LOX、CysLT1和CysLT2受體在神經(jīng)元中是否有表達?是否直接參與了神經(jīng)元的缺血性損傷?如果有，又是如何起作用的?這些基礎(chǔ)性問題至今沒有明確的答案。 本研究擬在原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的缺氧缺糖模型(oxygen-glucosedepr

4、ivation，OGD，一種經(jīng)典的離體腦缺血性損傷模型)上，闡明上述問題。 第一部分5-LOX途徑參與OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷膜磷脂在磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)的催化下，生成花生四烯酸(arachidonicacid，AA)；AA可通過二條主要途徑代謝，在環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)的作用下生成前列腺素類，在5-LOX和5-LOX激活蛋白(5-lipoxygenaseactiv

5、atingprotein，F(xiàn)LAP)的作用下生成LTs。為確證5-LOX途徑是否參與OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，我們觀察了興奮性氨基酸NMDA受體拮抗劑MK-801、PLA2抑制劑阿的平、5-LOX抑制劑咖啡酸、FLAP抑制劑MK-886、COX抑制劑吲哚美辛對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的作用。OGD1.5h，恢復(fù)24h后，神經(jīng)元的胞體破裂、突起斷裂，細胞碎片明顯增多；神經(jīng)元的活性顯著降低，約有35％神經(jīng)元死亡(MTT分析)。MK-801(5～

6、10μM)幾乎可完全逆轉(zhuǎn)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。阿的平(1～5μM)、咖啡酸(5～25μM)、MK-886(2～10μM)可濃度依賴性抑制OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷；而吲哚美辛(0.4～10μM)沒有顯示出保護作用。結(jié)果表明，5-LOX途徑參與OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷；5-LOX很可能在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中表達，并可被OGD激活。 第二部分NMDA受體可能部分介導(dǎo)OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元5-LOX激活在第一部分，我們已經(jīng)初步證實5-LO

7、X途徑參與OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。在這一部分，我們擬確證OGD是否可以激活大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中的5-LOX；如果是，它是否是通過NMDA受體介導(dǎo)的。免疫細胞化學(xué)、免疫印跡和5-LOX瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，在正常條件下，5-LOX主要集中在神經(jīng)元的細胞體，幾乎均勻地分布在細胞漿和細胞核內(nèi)；OGD損傷后，細胞漿和細胞核內(nèi)的5-LOX明顯減少，而核膜上5-LOX明顯增加，發(fā)生了明顯的5-LOX核膜移位(該酶激活的表現(xiàn)之一)。用酶免疫分析試劑盒測定5-

8、LOX的代謝產(chǎn)物L(fēng)Ts，我們發(fā)現(xiàn)在再灌0.5～1.5h的過程中CysLTs釋放顯著增加，但未檢測到白三烯B4(leukotrieneB4，LTB4)。為觀察興奮性氨基酸對5-LOX激活的調(diào)節(jié)，我們檢測了內(nèi)源性興奮性氨基酸—谷氨酸的釋放，并觀察谷氨酸和NMDA對5-LOX的激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD可誘導(dǎo)谷氨酸釋放，NMDA(100μM，0.5～1h)和谷氨酸(100μM，1h)也可誘導(dǎo)神經(jīng)元5-LOX核膜移位，NMDA可促使神經(jīng)元CysLT

9、s釋放增加。拮抗劑/抑制劑試驗表明，NMDA受體拮抗劑MK-801可抑制OGD和NMDA(谷氨酸)誘導(dǎo)的神經(jīng)元5-LOX核膜移位、CysLTs釋放增加，并可保護神經(jīng)元損傷。而5-LOX抑制劑咖啡酸、FLAP抑制劑MK-886不能抑制OGD和NMDA(谷氨酸)誘導(dǎo)的5-LOX的核膜移位，但能抑制CysLTs釋放增加，并可保護神經(jīng)元損傷。以上結(jié)果表明，OGD可激活大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中的5-LOX，其機制可能是促進興奮性氨基酸釋放，通過激活NMD

10、A受體介導(dǎo)5-LOX的激活。 第三部分CysLT1和CysLT2受體在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的表達和分布前二部分的實驗證實，在神經(jīng)元中有5-LOX的表達，并且可以被激活產(chǎn)生更多的CysLTs。另外，我們實驗室以往的研究表明，CysLT1受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特對實驗動物的腦缺血有保護作用。這些結(jié)果強烈提示，神經(jīng)元上可能有CysLT1和/或CysLT2受體的表達，并可能參與OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。在這一部分，我們擬確證在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元

11、中是否有CysLT1和CysLT2受體的表達；如果有，又分布在神經(jīng)元的什么部位。RT-PCR分析顯示，在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中有CysLT1和CysLT2受體mRNA的表達，但是CysLT1受體表達較少，而CysLT2受體表達較多。免疫組化分析顯示，CysLT1受體主要分布在神經(jīng)元的細胞膜上，而CysLT2受體主要分布在神經(jīng)元的細胞核內(nèi)。結(jié)果表明，大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元確實有CysLT1和CysLT2受體的表達；CysLT1和CysLT2受體(特別是

12、CysLT2受體)很可能參與神經(jīng)元的OGD損傷。 第四部分CysLT1和CysLT2受體激動劑和拮抗劑對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的作用CysLT1和CysLT2受體都是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，被激活后可誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣的升高。第三部分的研究表明，大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元上有CysLT1和CysLT2受體的表達。在這一部分，我們擬證實CysLT1和CysLT2受體激動劑LTD4對神經(jīng)元鈣信號的作用和神經(jīng)元活性的影響；CysLT1受體拮抗劑普魯司特、孟魯

13、司特，CysLT1/CysLT2受體非選擇性拮抗劑BAYu9773，對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的作用。LTD4(0.01～1μM)不能誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)鈣的升高，而NMDA(100μM)能誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)鈣顯著升高。MTT、碘化吡啶(propidiumiodide，PI)和Hoechst-33258分析顯示，LTD4(0.01～1μM)對神經(jīng)元的活性也沒有明顯的影響。OGD1.5h，再灌24h，可誘導(dǎo)神經(jīng)神經(jīng)元活性的顯著減少。MK-801(5μM)

14、可顯著保護OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷；但是普魯司特(0.4～10μM)、孟魯司特(0.4～10μM)、BAYu9773(0.04～1μM)對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷沒有表現(xiàn)出保護作用。結(jié)果表明，CysLT1和CysLT2受體激動劑和拮抗劑均不明顯影響神經(jīng)元反應(yīng)。這些結(jié)果與我們的預(yù)期及整體實驗結(jié)果不符，值得深入探討。整體腦缺血模型中神經(jīng)元CysLT1和CysLT2受體表達增加，可能由于細胞間或與其他分子相互作用的結(jié)果；普魯司特和孟魯司特對腦缺血

15、的保護作用，可能通過抑制血腦屏障破壞引起的腦微血管滲漏、腦水腫等缺血后炎癥反應(yīng)，而起的繼發(fā)性作用。 結(jié)論1.5-LOX途徑參與大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的OGD損傷，阻斷5-LOX途徑的任何一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，都可保護OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。 2.5-LOX在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中表達在神經(jīng)元的細胞漿、細胞核及突起。OGD或NMDA等興奮性氨基酸可激活5-LOX，發(fā)生核膜移位和生成CysLTs(但神經(jīng)元不產(chǎn)生LTB4)；其機制可能是促進興奮性氨

16、基酸釋放，通過激活NMDA受體介導(dǎo)5-LOX的激活。 3.CysLT1和CysLT2受體在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中有表達。CysLT1受體表達較少，主要分布在神經(jīng)元細胞膜；CysLT2受體表達較多，主要分布在神經(jīng)元細胞核。 4.CysLT1和CysLT2受體激動劑LTD4對神經(jīng)元活性沒有明顯影響；CysLT1受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特、CysLT1/CysLT2受體非選擇性拮抗劑BAYu9773對OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷無明顯作