1、目的：在HLAⅢ類基因區(qū)二代測(cè)序和生物信息學(xué)篩選基礎(chǔ)上，識(shí)別和驗(yàn)證與北方中國(guó)人群強(qiáng)直性脊柱炎（AS）遺傳易感性相關(guān)聯(lián)的基因變異。
　　方法：1)篩選本研究組通過(guò)高通量二代測(cè)序平臺(tái)，對(duì)25例hla-b27陽(yáng)性AS重癥患者HLAⅢ類基因區(qū)進(jìn)行深度測(cè)序，經(jīng)過(guò)BWA軟件的比對(duì)和samtool軟件讀取的變異，在該區(qū)域中經(jīng)生物信息學(xué)手段篩選出11個(gè)次要等位基因頻率小于5％的低頻罕見變異。2)識(shí)別先在一個(gè)340個(gè)病例和370個(gè)對(duì)照的小樣本中進(jìn)行

2、AS關(guān)聯(lián)的易感基因的識(shí)別研究，使用PCR-HRM和PCR-RFLP分型方法并結(jié)合隨機(jī)抽樣測(cè)序驗(yàn)證分型的結(jié)果。3)驗(yàn)證將小樣本中統(tǒng)計(jì)分析有意義的位點(diǎn)，進(jìn)行較大樣本（927病例和956對(duì)照）北方人群AS易感基因的關(guān)聯(lián)性研究，通過(guò)病例對(duì)照關(guān)聯(lián)研究，分型方法為PCR-HRM和PCR-RFLP，結(jié)合隨機(jī)抽樣測(cè)序驗(yàn)證分型的結(jié)果。4）分析用SPSS分析各變異位點(diǎn)等位基因和基因型在病例組和對(duì)照組中的分布情況，及不同遺傳模型中基因型的分布情況。經(jīng)HWE檢

3、測(cè),11個(gè)次要等位基因頻率在對(duì)照人群中符合HWE平衡條件,用haploview軟件進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)（LD）及單體型關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)行與AS關(guān)聯(lián)的危險(xiǎn)基因型的累積效應(yīng)分析，用多因子降維法（MDR）分析病例對(duì)照中各位點(diǎn)基因交互作用，識(shí)別具有意義的易感位點(diǎn)（P<0.05）。
　　結(jié)果：1)篩選對(duì)25例HLA-B27陽(yáng)性AS重癥患者HLAⅢ類基因區(qū)進(jìn)行深度測(cè)序。在該區(qū)域中經(jīng)生物信息學(xué)手段篩選出11個(gè)次要等位基因頻率小于5%的低頻罕見變異。2

4、)識(shí)別在340個(gè)病例和370個(gè)對(duì)照的第一階段小樣本群體中的識(shí)別研究結(jié)果顯示,aif1（rs371747459，A>G），bag6（rs201165258，A>G），ncr3（rs3179004，G>A），hspa1b（rs11576014，G>A），skiv2l（rs144147284，G>A）,tnxb（rs141190850，A>G），Chr6：g.31446930（C>A）和tnxb（rs139531139，G>A）共計(jì)識(shí)別到8個(gè)

5、有顯著性差異（P<0.05）的變異位點(diǎn)。3)驗(yàn)證這8個(gè)變異位點(diǎn)第二階段較大樣本群體的病例組與對(duì)照組中的等位基因分布均有差異（P<0.05），他們基因型頻率的共顯模型，顯性模型和超顯模型有意義。4）分析較大樣本單倍型分析結(jié)果：組合1顯示Chr6：g.31446930和rs3179004組成的單體型CG、CA、AG，組合2顯示rs371747459，rs201165258，rs11576014，rs144147284，rs139531139

6、和rs141190850組成的單體型AAGGGA、GGGGGA、AAGAAG，組合3顯示Chr6：g.31446930，rs3179004，rs371747459和rs201165258組成的單體型CGAA、CGGG、CAAA、AGAA，組合4顯示rs144147284，139531139和rs141190850組成的單體型GGA、AAG在病例組和對(duì)照組的分布具有差異性（P<0.05）。累積效應(yīng)分析結(jié)果顯示：隨著攜帶危險(xiǎn)基因型數(shù)目的增多

7、，OR值由1增加到12.639，再增加到18.727，含有越多危險(xiǎn)基因型個(gè)數(shù)，患AS風(fēng)險(xiǎn)性越大。MDR分析顯示：包含rs371747459、rs139531139、rs3179004和rs201165258這4個(gè)位點(diǎn)的最佳模型的testing P<0.0001,交叉驗(yàn)證一致性為10/10，檢驗(yàn)樣本的準(zhǔn)確度為0.6528。MDR環(huán)狀圖結(jié)果提示rs371747459、rs139531139、rs3179004和rs201165258這4個(gè)位

8、點(diǎn)之間有交互作用，然而只有rs139531139和rs3179004之間有協(xié)同作用。
　　結(jié)論：我們通過(guò)三步走的方法，1.在HLA-Ⅲ類基因區(qū)域中篩選出11個(gè)次要等位基因頻率小于5%的低頻罕見變異，2.在小樣本群體中識(shí)別出8個(gè)可能與AS相關(guān)聯(lián)的易感位點(diǎn)，3.在較大樣本多群體中驗(yàn)證結(jié)果顯示這8個(gè)易感位點(diǎn)可能與AS相關(guān)聯(lián)。單個(gè)基因分析：aif1（rs371747459，A>G），bag6（rs201165258，A>G），ncr3（r

9、s3179004，G>A），hspa1b（rs11576014，G>A），skiv2l（rs144147284，G>A）,tnxb（rs141190850，A>G），Chr6：g.31446930（C>A）和tnxb（rs139531139，G>A）這8個(gè)變異位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組中的等位基因分布均有差異（P<0.05），他們基因型頻率的共顯模型，顯性模型和超顯模型有意義。這8個(gè)變異位點(diǎn)可能與AS的易感性相關(guān)聯(lián)。多個(gè)基因分析：1）累積效應(yīng)

10、分析顯示隨著危險(xiǎn)基因型的數(shù)目增多，OR值增大，患AS風(fēng)險(xiǎn)性越大；2）單倍型分析結(jié)果顯示多個(gè)單倍型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，他們可能在遺傳上共同影響AS患者的發(fā)病；3）MDR結(jié)果顯示rs371747459、rs139531139、rs3179004和rs201165258這4個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成最佳模型，rs139531139和rs3179004之間有協(xié)同增加易感性的風(fēng)險(xiǎn)效用。我們實(shí)驗(yàn)中找到的這8個(gè)前人未報(bào)道過(guò)的易感位點(diǎn)可能與AS相關(guān)聯(lián)，我們進(jìn)一步的研究包括