1、一、背景及目的
　　 肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理改變，各種病因引起的慢性肝病或損害絕大多數(shù)都存在肝纖維化。肝纖維化是諸多肝病發(fā)展為肝硬化的必由之路，也是肝細(xì)胞肝癌的危險(xiǎn)因素之一，其中25％-40％最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。因此，肝纖維化是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的世界性疾病。肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆性的病變過(guò)程。所以，深入研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，積極有效的逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化，對(duì)防治肝硬化與肝癌具有重大的廣泛的經(jīng)

2、濟(jì)價(jià)值、社會(huì)意義和應(yīng)用前景。
　　 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)為一內(nèi)分泌系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，作用于全身多個(gè)器官。RAAS在器官纖維化中起著重要的作用。除了循環(huán)系統(tǒng)中存在RAAS，諸多器官，心，腎，肺，胰腺都存在局部或器官內(nèi)的RAAS，并且參與了組織器官纖維化和/或結(jié)構(gòu)重構(gòu)過(guò)程。肝臟局部也存在RAAS，以旁分泌、自分泌的方式發(fā)揮作用，參與肝纖維化的發(fā)展。這提示我們，RAAS可能是抗肝纖維化治療的潛在靶點(diǎn)。以往

3、認(rèn)為，經(jīng)典的腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)作用軸ACE-AngⅡ-AT1受體軸是其生物關(guān)聯(lián)性的唯一體系，對(duì)肝纖維化的形成具有促進(jìn)作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸亦為RAAS作用軸，是ACE-AngⅡ-AT1受體軸的反向調(diào)節(jié)軸，對(duì)肝纖維化的發(fā)生具有保護(hù)作用。AngⅡ作為RAAS的主要功能成分，具有促進(jìn)肝纖維化發(fā)展的重要作;而ACE2可裂解AngⅡ，生成Ang1-7，Ang-(1-7)對(duì)AngⅡ具有負(fù)向調(diào)節(jié)，對(duì)肝纖維化

4、具有保護(hù)作用。
　　 另一方面，在肝纖維化形成的過(guò)程中，細(xì)胞因子起了關(guān)鍵性的作用。細(xì)胞因子是一類(lèi)能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽，它們通過(guò)旁分泌或者自分泌的方式作用于靶細(xì)胞特定受體，發(fā)揮著局部生物學(xué)效應(yīng)。在肝纖維化的形成過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)存在表達(dá)的失衡，對(duì)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起了重要的促進(jìn)作用。
　　 當(dāng)前，

5、肝纖維化的治療仍以藥物為主，過(guò)去的10余年，RAAS阻滯劑中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑在心血管疾病、糖尿病、腎病等領(lǐng)域的地位被大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)所證實(shí)，而關(guān)于RAAS阻滯劑在肝病領(lǐng)域中的應(yīng)用，多來(lái)源于回顧性、非對(duì)照前瞻性研究或者是有類(lèi)似發(fā)病機(jī)制的其他疾病的治療經(jīng)驗(yàn)，對(duì)不合并心血管疾病、糖尿病、腎病的肝病患者仍不推薦應(yīng)用RAAS抑制劑抗肝纖維化治療，然而，對(duì)能耐受RAAS抑制劑的肝病患者，其積極作用

6、也不能忽視，值得進(jìn)一步研究。
　　 因此，本課題在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用(CC14)誘導(dǎo)制備大鼠肝纖維化模型，選用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯，分別干預(yù)RAAS不同環(huán)節(jié)，觀察其對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響，對(duì)血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)，RAAS組分ACE2、AngⅡ、Ang(1-7)，細(xì)胞因子TGF-β1、CTGF、

7、TNF-α的影響，以期明確干預(yù)RAAS哪個(gè)環(huán)節(jié)抗大鼠肝纖維化作用最佳，并探討其可能的作用機(jī)制，為肝纖維化的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 二、方法
　　 取6周齡SD(Sprague Dawley，SD)大鼠50只，隨機(jī)分為正常組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組和螺內(nèi)酯組，每組各10只。正常組皮下注射橄欖油，3ml/kg;其余大鼠予40％CCl4腹壁皮下注射，3 ml/kg，首劑加倍，1次/3d，制備大鼠肝纖維化模型;次日，卡托

8、普利組用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利60 mg/kg、氯沙坦組用血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體阻斷劑氯沙坦10 mg/kg、螺內(nèi)酯組用醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯100 mg/kg，均用10ml生理鹽水稀釋后灌胃，模型組和正常組用等量生理鹽水灌胃，1次/d。于第8周處死各組大鼠，收集血液及肝組織標(biāo)本。
　　 采用HE染色和Masson染色，光鏡觀察肝組織的病理形態(tài)學(xué)的變化;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ及RAAS組分AC

9、E2、AngⅡ、Ang(1-7)的濃度;應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)肝組織TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、TNF-α mRNA的表達(dá);Western blotting檢測(cè)肝組織TGF-β1蛋白、CTGF蛋白、TNF-α蛋白的表達(dá)。
　　 三、數(shù)據(jù)分析
　　 數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。方差齊時(shí)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

10、分析，多重比較采用LSD-t法檢驗(yàn);方差不齊時(shí)，用近似方差分析的Welch法，多重比較采用Dunnett T3法檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 四、結(jié)果
　　 所有大鼠無(wú)一脫失，均進(jìn)入實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，無(wú)皮下膿腫，無(wú)自噬及舔咬。
　　 1.各組大鼠體重正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組體重差異有顯著性意義。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，體重低于正常對(duì)照組，差異有

11、顯著性意義;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，體重高于模型組，差異有顯著性意義。氯沙坦組、螺內(nèi)酯組體重與卡托普利組相比差異無(wú)顯著性意義。
　　 2.各組大鼠肝濕重正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組肝濕重差異有顯著性意義。組間多重比較，正常對(duì)照組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，肝濕重低于模型組，差異有顯著性意義;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝濕重與正常對(duì)照組相比較，差異無(wú)顯著性意義。氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝濕重

12、與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義。
　　 3.HE染色結(jié)果光鏡下觀察肝臟組織病理變化，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，見(jiàn)肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周?chē)史派錉钆帕?，結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無(wú)變性壞死，成纖維細(xì)胞極少見(jiàn)到。模型組顯示肝細(xì)胞索排列較紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，匯管區(qū)擴(kuò)大，見(jiàn)假小葉形成。與模型組相比較，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組匯管區(qū)稍微擴(kuò)大，纖維間隔形成減少，未見(jiàn)假小葉形成。
　　 4.Masson染色結(jié)果正常組膠原纖維在血

13、管周?chē)猩倭康谋磉_(dá);模型組膠原纖維增生明顯，纖維間隔形成，可見(jiàn)弓形纖維，形成假小葉;與模型組相比較，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的膠原纖維明顯減少，形成的纖維間隔亦明顯減少，未見(jiàn)假小葉形成。
　　 5.各組大鼠肝纖維化半定量評(píng)分正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組肝纖維化半定量評(píng)分差異有顯著性意義。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維化半定量評(píng)分高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義;卡托普

14、利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維化半定量評(píng)分低于模型組，差異有顯著性意義。氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維化半定量評(píng)分與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義。
　　 6.各組大鼠肝纖維化面積百分比正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組肝纖維面積百分比差異有顯著性意義。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維面積百分比高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維面積百分比低于與模型組

15、，差異有顯著性意義。氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維面積百分比與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義。
　　 7.各組大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平
　　 7.1 HA:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組血清HA水平差異有顯著性意義。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組血清HA水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清HA水平低于模型組，差異有顯著性意義;

16、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組血清HA水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義。
　　 7.2 LN:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組血清LN水平差異有顯著性意義。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清LN水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清LN水平低于模型組，差異有顯著性意義;氯沙坦組、螺內(nèi)酯組血清LN水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義。
　　 7

17、.3 PCⅢ:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組血清PCⅢ水平差異有顯著性意義(F=213.310，P=0.000)。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清PCⅢ水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義((P＜0.05));卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清PCⅢ水平低于模型組，差異有顯著性意義((P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組血清PCⅢ水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義。
　　

18、7.4 CⅣ:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組血清CⅣ水平差異有顯著性意義(F=238.215，P=0.000)。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清CⅣ水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清CⅣ水平低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組血清CⅣ水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　

19、 8.各組大鼠血清ACE2、AngⅡ和Ang(1-7)水平
　　 8.1 ACE2:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組血清ACE2水平差異有顯著性意義（welch值=310.273，P=0.000）。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清ACE2水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清ACE2水平高于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05

20、);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組ACE2水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 8.2 AngⅡ:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組血清AngⅡ水平差異有顯著性意義（welch值=33.916，P=0.000）。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清AngⅡ水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清AngⅡ水平低于模型組，差異

21、有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組血清AngⅡ水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 8.3 Ang(1-7):正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組血清Ang（1-7）水平差異有顯著性意義（welch值=732.022，P=0.000）。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清Ang（1-7）水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利

22、組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清Ang（1-7）水平高于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，血清Ang（1-7）水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 9.各組大鼠肝組織ACE2、AngⅡ和Ang(1-7)水平
　　 9.1 ACE2:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組ACE2水平差異有顯著性意義(F=229.378，P=0.000)。組間多重比較，模型

23、組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，ACE2水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，ACE2水平高于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組ACE2水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 9.2 AngⅡ:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組AngⅡ水平差異有顯著性意義(F=52.695，P=0.000)。組間多重比較，

24、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，AngⅡ水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組AngⅡ水平低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組AngⅡ水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 9.3 Ang(1-7):正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組Ang（1-7）水平差異有顯著性意義(F=210.254，P=0.00

25、0)。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，Ang（1-7）水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，Ang（1-7）水平高于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組Ang（1-7）水平與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 10.各組大鼠肝組織TGF-β1mRNA、CTGF mRNA、TNF-αmRNA的表達(dá)
　　 10

26、.1 TGF-β1mRNA:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組TGF-β1mRNA表達(dá)差異有顯著性意義(welch值=162.836，P=0.000)。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，TGF-β1mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，TGF-β1 mRNA表達(dá)低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組TGF-β1 m

27、RNA的表達(dá)與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 10.2 CTGF mRNA:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組CTGF mRNA表達(dá)差異有顯著性意義(welch值=41.175，P=0.000)。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，CTGF mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，CTGF mRNA表達(dá)低于模型

28、組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組CTGF mRNA表達(dá)與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 10.3 TNF-αmRNA:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組TNF-α mRNA表達(dá)差異有顯著性意義(welch值=90.987，P=0.000)。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，TNF-α mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.

29、05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，TNF-α mRNA表達(dá)低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組TNF-α mRNA表達(dá)與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 11.各組大鼠肝組織TGF-β1、CTGF、TNF-α蛋白的表達(dá)
　　 11.1 TGF-β1蛋白:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組TGF-β1蛋白的表達(dá)，差異有顯著性意義(F=53.28

30、8，P=0.000)。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組TGF-β1蛋白表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，TGF-β1蛋白表達(dá)低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組TGF-β1蛋白表達(dá)與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 11.2 CTGF蛋白:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組CTGF蛋白

31、表達(dá)差異有顯著性意義（welch值=36.304，P=0.000）。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組CTGF蛋白的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，CTGF蛋白表達(dá)低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組CTGF蛋白表達(dá)與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 11.3 TNF-α蛋白:正常對(duì)照組、模型組、卡托普利組

32、、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，各組TNF-α蛋白表達(dá)差異有顯著性意義（welch值=41.812，P=0.000）。組間多重比較，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，TNF-α蛋白表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0.05);卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組，TNF-α蛋白表達(dá)低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05);氯沙坦組、螺內(nèi)酯組TNF-α蛋白表達(dá)與卡托普利組相比，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:

33、r>　　 1.本研究通過(guò)CCl4誘導(dǎo)，成功構(gòu)建了的大鼠肝纖維化模型。
　　 2.干預(yù)RAAS不同環(huán)節(jié)均能夠改善實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠的一般狀態(tài)。
　　 3.干預(yù)RAAS不同環(huán)節(jié)均能改善大鼠肝臟組織病理學(xué)改變，降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ的水平，改善實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠的肝臟纖維化程度，且效果無(wú)優(yōu)劣之分。
　　 4.干預(yù)RAAS不同環(huán)節(jié)抗肝纖維化的作用機(jī)制可能是通過(guò)升高循環(huán)和肝臟組織中ACE2、Ang(1-7)