1、【背景及目的】
　　全球約有2億人感染血吸蟲,流行于亞、非、拉,中國(guó)屬重感染區(qū)之一,其中1億2千萬人有臨床癥狀,2千萬人發(fā)病[1,2]。目前在中國(guó)仍有多達(dá)5千萬人面臨日本血吸蟲感染的危險(xiǎn)[3]。作為危害人類健康的常見寄生蟲疾病,血吸蟲肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究仍是臨床基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。
　　血吸蟲病肝纖維化在引起機(jī)體致病的同時(shí),機(jī)體也會(huì)對(duì)血吸蟲形成耐受機(jī)制,也因蟲體抗原偽裝逃避機(jī)體攻擊而得以長(zhǎng)期寄生。蟲卵沉積和肉芽

2、腫反應(yīng)導(dǎo)致纖維組織在肝臟中的積累,尤其門脈周圍纖維化阻塞通往肝臟的血流,最終形成門靜脈高壓。門靜脈高壓癥(portalhypertension,PHT)是一種常見的臨床綜合征,可引起嚴(yán)重并發(fā)癥危及生命。內(nèi)皮素(endothelin,ET),作為迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管肽類物質(zhì),它于1988由日本學(xué)者Yanagisawa等[4]從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來,分別有三種異構(gòu)肽:ET-1、ET-2、ET-3;其中,ET-1對(duì)血管平滑肌的作

3、用最強(qiáng)。內(nèi)皮素受體(endothelinreceptor,ETR)則分為ETAR和ETBR,ETAR與ET的親和力表現(xiàn)為:ET-1>ET-2?ET-3,ETBR則與三種異構(gòu)肽親和力相同。眾所周知,ETR的表達(dá)數(shù)量及功能決定了ET的生物學(xué)效應(yīng)。動(dòng)物體內(nèi)許多組織都能同時(shí)表達(dá)ETAR和ETBR,但各組織的ETR比例卻各有不同;組織ETR的分布情況決定了ET在該組織的作用,ET與其受體之間也可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制;在PHT的不同階段,同一組織內(nèi)

4、皮素受體的表達(dá)分布也不相同;有關(guān)ETR受體拮抗劑已經(jīng)為藥物治療提供了新的研究領(lǐng)域。
　　肝纖維化發(fā)生發(fā)展離不開肝星狀細(xì)胞(Hepaticstellatecells,HSCs)持續(xù)激活。HSCs在激活的過程中會(huì)表達(dá)細(xì)胞因子及其受體,如ET-1和ET-1A、B型受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)和TGF-βI、II、III型受體、血小板衍生的生長(zhǎng)因子Plateletderivedgr

5、owth-factor,PDGF)和PDGF受體的α、β亞單位等等。低氧、年齡、活化狀態(tài)、分布密度等均可影響HSCs表面受體的表達(dá)。HSCs與內(nèi)皮素系統(tǒng)(Endothelinsystem,ETS)相互作用,其效應(yīng)在肝內(nèi)外血管阻力形成、門靜脈血流量變化及肝纖維化進(jìn)展中都起到關(guān)鍵作用[5,6]。
　　HSP47(heatshockprotein47,HSP47)是機(jī)體受到應(yīng)激后合成增加的應(yīng)激蛋白,主要存在于肝星狀細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,參與膠

6、原的折疊與分泌,影響肝纖維化的進(jìn)展[7]。HSP47在多種疾病纖維化病理過程中顯著上調(diào),其參與膠原合成,其表達(dá)量影響纖維化進(jìn)展;抑制HSP47表達(dá)可抑制膠原合成及組織纖維化[8,9]。血吸蟲感染所引起的肝纖維化與ETR表達(dá)的關(guān)系,國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少;HSP47在肝纖維化病理過程中究竟如何調(diào)控,目前也有待進(jìn)一步深入研究;本研究旨在應(yīng)用HSP47-shRNA干預(yù)鼠血吸蟲肝纖維化,探索其對(duì)HSCs受體表達(dá)的影響,尋找新的診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。

7、>　　【方法】
　　利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的HSP47-shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細(xì)胞(NIH/3T3細(xì)胞),同時(shí)設(shè)立非相關(guān)對(duì)照組(Negativecontrol-shRNA)。分別利用實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot方法檢測(cè)NIH/3T3細(xì)胞HSP47mRNA及蛋白水平的表達(dá);流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NIH/3T3膜受體表達(dá)。上述同樣分組,將shRNA干擾質(zhì)粒經(jīng)尾靜脈高壓注射,自日本血吸蟲小鼠感染第9W開始干預(yù)至

8、感染第14W,動(dòng)態(tài)檢測(cè)模型門靜脈壓力改變;實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot檢測(cè)體內(nèi)干預(yù)HSP47效應(yīng);流式檢測(cè)HSCs膜受體表達(dá)變化。
　　【結(jié)果】
　　Real-timePCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NIH/3T3細(xì)胞HSP47-mRNA表達(dá),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h(圖2,A)干擾質(zhì)粒對(duì)HSP47-mRNA抑制相對(duì)表達(dá)量為(25.39±2.358)％、轉(zhuǎn)染48h(圖2,B)為(48.71±1.391)%,分別于同轉(zhuǎn)染時(shí)間非相關(guān)對(duì)照組

9、比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48hHSP47蛋白表達(dá),結(jié)果與HSP47-mRNA一致。同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ET-B受體表達(dá),轉(zhuǎn)染48h為(30.825±5.460)%,與轉(zhuǎn)染前(53.433±5.243)%有顯著差異(p<0.05)。TGF-β受體、PDGF受體分別檢測(cè),轉(zhuǎn)染前后均無顯著變化。
　　感染第9周,尾靜脈注射HSP47-shRNA至感染第14W,HSP47-mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)至(2

10、.686±0.7114),與對(duì)照組(6.001±0.4583)比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。HSP47蛋白表達(dá)經(jīng)Western-blot檢測(cè),與mRNA變化一致。ShRNA干預(yù)組HSCsETAR與ETBR平均熒光強(qiáng)度(MFI)與感染組相比,均顯著變化(p<0.05)。ETAR由感染組(8538±493.71)降至(4249±344.42),ETBR則由感染組(5052±212.93)降至干預(yù)組(3706±193.76)。