1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是慢性炎癥反應和免疫性疾病，是冠心病的主要病理基礎。在AS斑塊中可發(fā)現(xiàn)大量的T淋巴細胞，其中以CD4+T淋巴細胞為主，CD4+T淋巴細胞亞群的失衡與急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)發(fā)生關系密切。易損斑塊中大量活化的T淋巴細胞降低斑塊的穩(wěn)定性，使斑塊易于破裂。不穩(wěn)定型心絞痛(Unstableangina pectoris，UAP)的患者及急性心肌梗

2、死患者，心肌微血管內存在血小板血栓，在心肌微循環(huán)水平形成微栓塞，導致心肌微梗死。因此，CD4+T淋巴細胞可能間接的參與了ACS患者心肌損傷的過程。
　　術后心肌損傷仍然是經皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronaryintervention，PCI)常見的并發(fā)癥，但其機制目前尚不完全清楚。有研究表明，PCI術前大劑量的他汀可以有效的降低炎癥因子水平，保護心肌。因此，炎癥和免疫反應也是PCI術后心肌損傷的重要原因之

3、一。還有研究表明，PCI對血管壁的損傷可以導致外周血淋巴細胞的顯著激活和氧化應激產物標志物的顯著增高，外周血激活的CD4+T淋巴細胞表達的CD18分子可促進白細胞招募并粘附于受損的內皮細胞。因此，炎癥反應及以CD4+T淋巴細胞介導的免疫反應直接參與了PCI術后心肌損傷的過程。
　　微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)是一類長約18～25個核苷酸的小分子RNA。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA也參對與AS發(fā)生發(fā)展密切相關的炎性細胞如單

4、核/巨噬細胞、淋巴細胞及內皮細胞的調控。
　　雖然目前miRNA在T淋巴細胞調控中的研究取得了重大的進展，但仍屬于起步階段，并且在不同的疾病狀態(tài)和疾病發(fā)展的不同階段，miRNA表達和作用亦不盡相同，與T淋巴細胞活化和功能調控相關的miRNA在UAP及PCI術后心肌損傷中的生物學功能尚未闡明。
　　本研究擬通過miRNA基因芯片技術篩選出UAP患者外周血CD4+T淋巴細胞異常表達的miRNA，闡明異常表達的miRNA對CD4+

5、T淋巴細胞活化、分化及功能調控的機制。同時探討miRNA在PCI術后的變化及與心肌損傷相關性。
　　第一部分 UAP患者循環(huán)血CD4+T淋巴細胞差異表達miRNA的篩選及鑒定
　　目的:通過檢測UAP患者循環(huán)血CD4+T淋巴細胞中基因的miRNA表達譜，篩選與正常對照者差異表達的miRNA，尋找對CD4+T淋巴細胞具有調控作用的miRNA，為進一步闡明miRNA在UAP發(fā)病機制中的作用提供基礎。
　　方法:選取入住我院

6、的典型UAP患者3例，以疑似不典型冠心病癥狀而冠脈造影正常的住院患者3例作為正常對照組，抽取新鮮外周靜脈血20ml。利用密度梯度離心法分離出UAP患者和正常對照者循環(huán)血中的單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），免疫磁珠法(Magneticcell sorting system，MACS)進一步分離出CD4+T淋巴細胞。采用流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測所分離C

7、D4+T淋巴細胞的純度，臺酚藍檢測活細胞數。Trizol一步法提取細胞總RNA，取40μg總RNA，用聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）方法分離純化miRNA。用分光光度計測定RNA的濃度，甲醛變性膠電泳質檢RNA的質量。采用AffymetrixmiRNA基因表達譜芯片進行雜交，檢測CD4+T淋巴細胞miRNA的表達譜。用Affymetrix GeneChip Scanner3000基因芯片掃描儀進行圖像掃描，A

8、ffymetrix GeneChip Command ConsoleTM1.1圖像分析軟件對圖像進行分析，把圖像信號轉化為數字信號，然后用SAM軟件（版本3.02）處理數據，篩選出UAP患者和正常對照者CD4+T淋巴細胞差異表達的miRNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time polymerase chain reaction，real timePCR)對部分差異表達的miRNA進行驗證。
　　結果:miRNA基因

9、芯片篩選結果顯示，相對于正常對照者，UAP患者外周血CD4+T淋巴細胞中表達顯著上調的miRNA有miR-155，miR-21，miR-424和miR-127-3p，顯著下調的有miR-30b和miR-181a。real time PCR進一步驗證的結果表明，上述差異表達miRNA的變化趨勢及變化倍數與miRNA基因芯片篩選結果一致。
　　結論:篩選得到的UAP患者循環(huán)血CD4+T淋巴細胞miRNA差異表達譜，可能與參與了UAP的

10、發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分:miRNA-155對UAP患者CD4+T淋巴細胞亞群分化和功能的影響
　　目的:通過研究微小核糖核酸-155(miRNA-155)對UAP患者外周血CD4+T淋巴細胞的調控作用，從而揭示miRNA-155在UAP發(fā)病中的作用機制。
　　方法:選取入住我院的UAP患者10例，抽取新鮮外周靜脈血。采用密度梯度離心法分離出UAP患者PBMC，MACS法進一步分離出CD4+T淋巴細胞，用無血清RPMI

11、1640培養(yǎng)基調整為2×106/ml，隨后分為四組:對照組、miRNA-155模擬體組和阻遏物組，以另一孔轉染熒光對照的FAM-siRNA作為熒光對照。對照組加入陰性對照的模擬體（終濃度為50nM），miRNA-155模擬體組中加入的為miRNA-155模擬體（終濃度為50nM），阻遏物組加入的miRNA-155模擬體和miR-155阻遏物（終濃度分別為50nM），同時加入脂質體2000，共轉染5h。隨后加入植物凝血素刺激CD4+T淋巴

12、細胞活化后，收集細胞及上清。流式細胞術檢測CD4+T淋巴細胞Th1和Th2亞群數量，提取CD4+T淋巴細胞總RNA和蛋白，real time PCR檢測γ干擾素受體α鏈（Interferon-gamma receptor alpha chain，IFN-γRα）、T細胞表達的T盒(T boxexpressed in T cells，T-bet)、GATA結合蛋白3（GATA binding protein3，GATA-3）mRNA的表達

13、;蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測IFN-γRα、T-bet、GATA-3蛋白的表達;酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測細胞培養(yǎng)液上清γ干擾素(Interferon-gamma，IFN-γ)、白細胞介素4(Interleukin-4，IL-4)的表達。對IFN-γRα與IFN-γ、 IL-4的表達進行直線相關性分析。
　　結果:流式細胞檢測結果顯示，

14、miRNA-155模擬體組的IFN-γ陽性CD4+T淋巴細胞計數較對照組顯著增加[(63.19±8.61)％ vs(47.17±10.28)％，P＜0.01]，阻遏物組較miRNA-155模擬體組降低[(52.87±10.05)％ vs(63.19±8.61)％，P=0.024]。三組間IL-4陽性CD4+T淋巴細胞計數無明顯差異(F=0.228，P=0.798)。與對照組比較，miRNA-155模擬體組T-bet mRNA表達顯著增加

15、(P＜0.01)，與miRNA-155組比較，阻遏物組T-bet mRNA表達降低(P＜0.01);三組間IFN-γRα、GATA-3的mRNA表達無明顯差異（分別F=1.055，P=0.362; F=1.601，P=0.220）。與對照組比較，miRNA-155模擬體組IFN-γRα蛋白表達顯著減少，T-bet蛋白表達顯著增加（均P＜0.01）;與miRNA-155模擬體組比較，阻遏物組IFN-γRα蛋白表達增加，T-bet蛋白表達減

16、少（均P＜0.01）;三組間GATA-3蛋白表達無明顯差異(F=0.098，P=0.907)。與對照組比較，miRNA-155模擬體組的IFN-γ顯著增高（P＜0.01），阻遏物較miRNA-155模擬體組降低（P＜0.01）;三組間IL-4表達無明顯差異(F=0.384，P=0.685)。相關分析表明，IFN-γRα蛋白表達與IFN-γ表達呈顯著負相關（r=-0.775，P＜0.01），與IL-4表達無相關關系（r=0.041，P=0

17、.832）。
　　結論:miRNA-155主要通過影響Th1細胞的分化和功能，參與對CD4+T淋巴細胞的調控，在UAP發(fā)病中起重要的作用。miRNA-155的作用可能部分與調控靶基因IFN-γRα的表達有關。
　　第三部分 CD4+T淋巴細胞異常表達miRNA-155與UAP患者介入治療術后心肌損傷的關系
　　目的:初步探討異常表達m iRNA-155與UAP患者在PCI術后心肌損傷關系，為進一步闡明miRNA在PCI

18、術后心肌損傷機制中的作用提供理論基礎。
　　方法:選取2010年1月至12月入住我院并行PCI的UAP患者41例，其中PCI術后肌鈣蛋白升高超過正常參考值3倍20例，肌鈣蛋白正常者21例，同時以18例疑似不典型冠心病癥狀而冠脈造影正常的住院患者為正常對照組。Real time PCR檢測患者循環(huán)血CD4+T淋巴細胞miRNA-155在PCI術前和術后12h的表達水平，western blotting檢測術前和術后12h IFN-γ

19、Rα蛋白的表達，ELISA法測定PCI術前和術后12h血清IFN-γ和IL-4的表達。對miRNA-155的表達水平和IFN-γRα蛋白、血清IFN-γ和IL-4進行相關性分析。
　　結果:UAP患者術前miRNA-155、IFN-γ明高于對照組（均P＜0.01），IFN-γRα蛋白表達低于對照組（均P＜0.01），IL-4表達無差異（均P＞0.05）。術前肌鈣蛋白陽性組miRNA-155、IFN-γRα蛋白和IFN-γ表達水平與

20、肌鈣蛋白陰性組無明顯差異（均P＞0.05）;術后12小時，肌鈣蛋白陽性組與肌鈣蛋白陰性組的miRNA-155、hsCRP、IFN-γ表達均顯著增高（均P＜0.05），且肌鈣蛋白陽性組較肌鈣蛋白陰性組增高更為明顯(P＜0.05);IFN-γRα蛋白表達顯著低于（均P＜0.01），肌鈣蛋白陽性組較肌鈣蛋白陰性組降低更為明顯(P＜0.01)。兩組術前、術后血清IL-4水平無明顯差異。術前、術后miRNA-155表達與IFN-γ呈顯著正相關（分

21、別r=0.649，P＜0.01;r=0.682，P＜0.01），與IFN-γRα蛋白表達呈顯著負相關（分別r=-0.536，P＜0.01;r=-0.592，P＜0.01），與IL-4無明顯相關關系（分別r=-0.165，P=0.303; r=0.107，P=0.506）。
　　結論:miRNA-155參與了UAP患者中Th1細胞活化及細胞因子IFN-γ分泌的調控過程;miRNA-155表達與PCI術后心肌損傷存在明顯的相關關系，m