1、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率約占全部顱內(nèi)腫瘤的40％；目前盡管腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療方法在不斷地改善和提高，但其治療仍然沒有顯著提高，而且患者預(yù)后較差，平均生存期還不到一年。治療困難的主要原因在于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性生物學(xué)特性；因此，為了進(jìn)一步改善腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療效果，尋找和研究在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用的相關(guān)分子具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　NOK（NovelOncogenewithKi

2、nase-domain）基因是2004年從人扁桃體癌中克隆的一個(gè)新的癌基因（基因登錄號(hào)為GenebankAAT01226），屬于受體型酪氨酸蛋白激酶家族的一員。NOK基因組全長2.79kb，位于染色體12q13.2，mRNA全長1269bp，能夠編碼422個(gè)氨基酸，分子量約為47.6kD的蛋白質(zhì)。NOK基因廣泛高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織，如肺癌（A549）、乳腺癌（MDA-MB-231）、急性髓系白血病（HL-60、U937和K56

3、2）、卵巢癌（HS832、OvCar3和CaOv3）和前列腺癌（LNCaP）等；這些都預(yù)示著NOK蛋白可能對(duì)腫瘤生成有一定的調(diào)控作用。但是目前尚未有關(guān)NOK基因與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)性研究的報(bào)道。NOK分子能否成為有價(jià)值的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤治療的新靶點(diǎn)需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。
　　本課題系統(tǒng)地研究了NOK分子在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)特征，揭示了NOK分子在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)特征及其與腫瘤病理分級(jí)的關(guān)系；本研究還初步探討了NOK分子在不同表達(dá)水

4、平下對(duì)于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖、侵襲、凋亡以及裸鼠致瘤性的影響，這些都有助于揭示NOK分子在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性進(jìn)展中所發(fā)揮的作用。本課題主要包括以下四方面研究：
　　1.NOK在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義
　　本研究首先從mRNA和蛋白水平研究了NOK分子在83例人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織、10例正常人腦組織以及3株人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U251、BT325和U87）中的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse-transcripti

5、onPCR，RT-PCR）和Westernblot研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOKmRNA和蛋白在U251和U87細(xì)胞中表達(dá)水平均較高，而BT325細(xì)胞中NOKmRNA和蛋白表達(dá)較低；在10例正常人腦組織中，只有1例檢測(cè)到NOKmRNA和蛋白表達(dá)，其余9例均未見NOK的表達(dá)；而NOKmRNA和蛋白在不同病理級(jí)別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，并且其表達(dá)強(qiáng)度隨著臨床病理級(jí)別的增高，NOK的表達(dá)有增高的趨勢(shì)。本研究進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了NOK蛋白在人腦

6、膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)。結(jié)果提示：NOK蛋白陽性染色定位于胞漿和/或胞膜；在83例人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤標(biāo)本中，57例標(biāo)本表達(dá)檢測(cè)到NOK表達(dá)，表達(dá)陽性率為68.7％，而10例正常人腦組織中只有1例表達(dá)。在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤及正常人腦組織中，NOK蛋白陽性表達(dá)率存在顯著差異（P<0.01）。并且，NOK蛋白表達(dá)陽性率隨著臨床病理級(jí)別的增高而顯著升高，在I～I(xiàn)V級(jí)腫瘤組織間差異顯著（P<0.05）；但是其與患者性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤的

7、發(fā)生部位無關(guān)（P均>0.05）。本部分研究結(jié)果表明，NOKmRNA和蛋白在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和部分細(xì)胞系中高表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度隨著腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤病理級(jí)別的升高而增高。
　　2.NOK慢病毒表達(dá)載體及慢病毒干涉載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的研究
　　根據(jù)NOK的cDNA全長特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了PCR引物，成功的從獲贈(zèng)真核表達(dá)載體pcDNA3.1-NOK中獲得了NOK的cDNA全長，將其克隆入Gateway系統(tǒng)中入門克隆載體pENTR/3C中，重

8、組體pENTR/3C-NOK酶切、PCR和測(cè)序鑒定；然后利用重組反應(yīng)（Gateway?LRClonase?Reaction），將pENTR/3C-NOK重組體中的NOK全長導(dǎo)入慢病毒載體pLenti-6.3/V5中，重組體pLenti-6.3/V5-NOK酶切、PCR鑒定和測(cè)序；pLenti-6.3/V5-NOK和對(duì)照質(zhì)粒pLenti-6.3/V5-cherry分別與輔助質(zhì)粒psPAX2,pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分別轉(zhuǎn)染

9、293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。慢病毒感染BT325細(xì)胞，Blasticidin抗性篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株分別命名為BT325-NOK和BT325-cherry細(xì)胞，RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中NOKmRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與BT325-cherry細(xì)胞相比，BT325-NOK細(xì)胞中的NOKmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　將購買兩個(gè)NOK慢病毒干涉載體（pLKO.1-NOK-1和pLKO.1-NOK-

10、2）及對(duì)照載體scramble分別與輔助質(zhì)粒psPAX2,pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。慢病毒感染U251細(xì)胞，嘌呤霉素抗性篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株分別命名為U251-sh1、U251-sh2和U251-control細(xì)胞，RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中NOKmRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與U251-control細(xì)胞相比，U251-sh1和U251-sh2細(xì)胞中的NOKm

11、RNA和蛋白表達(dá)水平均受到明顯抑制。
　　本部分結(jié)果提示：成功構(gòu)建含有NOK全長的慢病毒表達(dá)載體，將該載體和NOK慢病毒干涉載體分別進(jìn)行病毒包裝，分別感染腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，成功的建立了上調(diào)或抑制NOKmRNA和蛋白表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，為下一步研究NOK分子在調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用提供了良好的細(xì)胞模型。
　　3.上調(diào)或抑制NOK基因的表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　本部分針對(duì)已經(jīng)建立的兩組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（U

12、251-sh1、U251-sh2、U251-control和BT325-NOK、BT325-cherry）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。首先觀察了NOK基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響；MTT繪制生長曲線顯示：與U251-control細(xì)胞相比，U251-sh1和U251-sh2細(xì)胞生長、增殖均受到明顯抑制（P<0.05）；BT325-NOK細(xì)胞的增殖明顯增快，顯著高于BT325-cherry細(xì)胞（P<0.01）。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)

13、驗(yàn)用來測(cè)定細(xì)胞克隆形成數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：U251-sh1和U251-sh2細(xì)胞增殖數(shù)和克隆形成數(shù)均明顯低于其對(duì)照組（P<0.01）；BT325-NOK細(xì)胞增殖數(shù)和克隆形成數(shù)則顯著高于其對(duì)照組（P<0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)：與U251-control細(xì)胞相比，U251-sh1和U251-sh2兩組細(xì)胞的G1期細(xì)胞均明顯增加（P<0.01），G2/M期細(xì)胞均明顯減少（P<0.01），發(fā)生了G1期阻滯；與對(duì)照組BT325-

14、cherry細(xì)胞相比，BT325-NOK細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞明顯減少（P<0.01），S期細(xì)胞顯著增多（P<0.01），G2/M期細(xì)胞略有增多。其次我們運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲小室法觀察了NOK基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)：U251-sh1和U251-sh2兩組細(xì)胞的遷移能力均明顯低于其對(duì)照組（P<0.01），而且在Transwell實(shí)驗(yàn)中，U251-sh1和U251-sh2兩組細(xì)胞穿過Matrigel的細(xì)胞

15、數(shù)也均明顯低于其對(duì)照組（P<0.01）；與BT325-cherry細(xì)胞相比，BT325-NOK細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯增加（P<0.01）。
　　本部分研究結(jié)果表明，NOK基因可能在調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖和侵襲等惡性生物學(xué)特性中發(fā)揮重要作用。
　　4.NOK基因RNAi對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤、增殖以及侵襲的影響本部分研究U251-control、U251-sh1和U251-sh2三種細(xì)胞分別接種于裸鼠背部皮下，

16、定期測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察其在裸鼠體內(nèi)的成瘤性。共觀察了30天。Westernblot方法檢測(cè)移植瘤組織中NOK蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：U251-sh1和U251-sh2兩組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力和生長速度均明顯低于其對(duì)照組（P<0.01），腫瘤體積和重量也均明顯低于其對(duì)照組（P<0.01）；結(jié)果顯示與U251-control組相比，U251-sh1和U251-sh2組的腫瘤中NOK蛋白表達(dá)均明顯抑制（P<0.01