1、近年來，結核病的疫情呈現(xiàn)重新上升的趨勢。引起全球結核感染疫情回升的主要因素之一是耐藥結核分枝桿菌，尤其是耐多藥結核分枝桿菌的出現(xiàn)及其引起疾病的流行。我國結核的耐藥情況尤為嚴峻，總耐藥率為27.8％，耐多藥率高達10.7％，由此而造成的結核病患病率和死亡率居高不下。因此，快速準確的檢測結核分枝桿菌耐藥性成為結核病防治工作的當務之急，是制定恰當?shù)幕煼桨傅闹匾罁?jù)。 異煙肼(Isoniazid，INH)是最有效的抗結核藥物之一。隨著

2、分子生物學技術的發(fā)展，異煙肼耐藥機制的逐步明了，現(xiàn)已證實結核分枝桿菌異煙肼耐藥主要與katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC等基因突變有關。 為了深入了解我國結核分枝桿菌異煙肼耐藥相關基因突變情況，明確其突變位點的分布、主要突變位點及其發(fā)生率，本研究從西藏、湖南、河南、四川、福建、安徽和陜西七省收集結核分枝桿菌臨床分離菌株，首先對其采用生化反應方法進行菌種鑒定并用比例法進行藥物敏感性試驗，其后用聚合酶鏈反

3、應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC等基因，進行DNA測序分析，根據(jù)檢測結果分析基因突變類型及與耐藥之間的關系，并分析統(tǒng)計發(fā)生突變的各位點的突變率。 我們共收集到536株分枝桿菌臨床分離株，用鑒別培養(yǎng)基進行了菌種鑒定，89.93％為結核分枝桿菌，3.54％為牛分枝桿菌，6.16％為非結核分枝桿菌，0.37％為結核分枝桿菌加非結核分枝桿

4、菌的混合感染。 采用比例法對482株結核分枝桿菌進行藥物敏感性試驗，對四種抗結核一線藥物(SM，RFP，INH，EMB)和一種二線藥物(PAS)全部敏感的菌株為118株，占全部被測菌株的24.48％；耐藥菌株364株，占全部被測菌株的75.52％，其中，單耐藥菌株88株，占18.26％；多耐藥菌株276株，占57.26％。 針對結核分枝桿菌異煙肼耐藥的相關基因katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahp

5、C設計引物，應用聚合酶鏈反應和DNA序列分析對結核分枝桿菌標準株H<,37>Rv及291株臨床分離菌株，包括全敏感株64株，異煙肼相對敏感株48株，異煙肼單耐藥株30株，聯(lián)合耐藥株149株進行耐藥基因突變檢測。 測序分析結果顯示：(1)179株異煙肼耐藥菌株中，163株發(fā)現(xiàn)耐藥基因“熱點突變區(qū)”突變，112株INH敏感株中有3株發(fā)生KatG基因的突變。與常規(guī)藥敏試驗比例法比較，DNA測序法檢測的靈敏度為91.06％(163/17

6、9)，特異度為97.32％(109/112)，陽性預測值98.19％(163/166)，陰性預測值87.20％(109/125)，符合度為93.47％(272/291)，兩種方法檢測的結果之間的差異無統(tǒng)計學意義(x<'2>=7.58，P>0.05)。(2)179株異煙肼耐藥菌株中，463位點發(fā)生突變的有129株，占72.07％，112株異煙肼敏感株中，463位點發(fā)生突變的有74株，占66.07％，耐藥株和敏感株間的突變率差異無統(tǒng)計學意義

7、(x<'2>=1.1739，P>0.05)，證實INH耐藥與Arg463Leu突變無相關性。(3)在179株異煙肼耐藥菌株中，138株(77.09％)異煙肼耐藥株katG存在點突變，其中7個位點尚未見報道，131株(73.18％)耐藥株第315位點突變，涉及4種突變類型，但主要是AGC(Ser)→ACC(Thr)的突變，共123株，占這個位點突變的93.89％。未發(fā)現(xiàn)katG的缺失與插入。(4)1株(0.56％)耐藥株inhA發(fā)生突變，

8、敏感株中未檢測到突變。(5)18株(10.06％)耐藥株oxyR-ahpC基因連接區(qū)發(fā)生點突變，其中7株發(fā)生-9C→T的突變，占突變的3.39％，另有3株發(fā)生-5G→A的突變，3株發(fā)生-14C→T的突變等；敏感株中未檢測到突變。(6)3株(1.68％)耐藥株ndh存在點突變，突變類型為第191位點的GAG(Glu)→GGG(Gly)，敏感株中未檢測到突變。(7)檢測179株耐藥菌株的pre-inhA基因，-15C→T的突變有12株，占6

9、.67％，其中9株發(fā)生的是單點突變而沒有其他位點及其他相關基因突變，其他的突變還見于-19G→A、-8T→C、13G→C，敏感株中未檢測到突變。(8)在全部菌株中未發(fā)現(xiàn)oxyR和ahpC基因突變。(9)綜合本試驗中各基因的變化情況，共有163株耐異煙肼菌株發(fā)生與異煙肼表型耐藥相關的突變。本項研究進一步證實了結核分枝桿菌耐異煙肼與katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC基因突變之問的關系，為下一步耐藥芯片的探針設計