1、暴發(fā)性肝炎(Fulminant viral hepatitis,FH)是全球廣泛存在的肝臟疾病,在中國其發(fā)病致死率逐年上升已經(jīng)位列全球第三。導(dǎo)致暴發(fā)性肝炎的原因主要有5種,分別為:病毒性肝炎(HAV和 HBV),藥物濫用(撲熱息痛),特殊藥物反應(yīng),有毒物質(zhì)的攝取以及機體的代謝紊亂,但因其具體發(fā)病機制還不是十分清楚,所以對暴發(fā)性肝炎進行研究尤為重要。建立暴發(fā)性肝炎模型的方法是運用小鼠肝炎病毒 MHV-3誘導(dǎo)完成,此模型能很好的模擬暴發(fā)性肝

2、炎發(fā)病過程,對其發(fā)病機制進行研究并制定相應(yīng)的方案進行治療。MHV-3是隸屬冠狀病毒科的單正鏈RNA病毒,它可以導(dǎo)致敏感品系 Balb/c和 C57BL/6小鼠發(fā)生嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死,致小鼠死亡。但對于抗性品系如A/J小鼠在感染病毒后則不表現(xiàn)出任何臨床癥狀,經(jīng)證實A/J小鼠體內(nèi)補體C5分子由于缺乏特異性酶不能自然合成,所以我們推測補體 C5分子參與了重癥肝炎的發(fā)病,同時現(xiàn)如今文獻和實驗均指向暴發(fā)性肝炎的死亡原因與一種新型凝血酶原酶纖維介素2

3、(Fibrinogen like protein2/fibroleukin, FGL2)密切相關(guān),在暴發(fā)性肝炎中,FGL2能裂解凝血酶原為有活性的凝血酶,啟動凝血級聯(lián)反應(yīng),引起纖維蛋白沉積,致使血管內(nèi)凝血,肝血竇血栓形成,肝細(xì)胞壞死,最終導(dǎo)致小鼠死亡,因而我們提出假設(shè):暴發(fā)性肝炎發(fā)病中補體C5分子能對Fgl2進行直接或間接的調(diào)節(jié)而影響小鼠的存活。基于這樣的假設(shè),本研究以Balb/c小鼠和C5aRKO小鼠做為研究對象,MHV-3作為研究手

4、段,輔以正常人和臨床暴發(fā)性肝炎病人做為研究參照,旨在探討補體 C5分子活化產(chǎn)物C5a與其受體C5aR在暴發(fā)性肝炎發(fā)病中的作用及機制。
　　補體系統(tǒng)作為先天免疫防御機制中的一部分,它的激活在維持細(xì)胞完整和調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著重要作用,已知補體的激活途徑主要有3條:經(jīng)典途徑,旁路途經(jīng)及凝集素途徑。補體系統(tǒng)通過三種途徑激活后能夠保護機體并清除入侵的病原物質(zhì),同時通過活化后配體與受體的相互作用對細(xì)胞自身進行修正并調(diào)節(jié)。文獻報道,急性感

5、染模型如自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis),氣道變異性炎癥及膿毒癥中,補體活化產(chǎn)物C5a能夠與其受體C5aR相互結(jié)合發(fā)揮作用,加速疾病進展,同時在這些疾病模型中均能檢測到大量補體活化片段C5a的產(chǎn)生,致使炎癥反應(yīng)加重。MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎同屬急性感染模型,那么在這樣的模型中補體活化片段C5a是否也能與C5aR結(jié)合發(fā)揮作用,影響疾病進程呢?帶著這樣的疑

6、問,我們首先用100PFU的 MHV-3病毒感染 Balb/c和C5aRKO小鼠,發(fā)現(xiàn)Balb/c小鼠在感染3天內(nèi)全部死亡,相比相同劑量感染的C5aRKO小鼠,超過80％的小鼠在感染后得以存活;鏡下觀察Balb/c小鼠肝組織壞死區(qū)明顯,而C5aRKO小鼠的肝臟形態(tài)則趨于正常;血清學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)C5aRKO小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)水平明顯低于Balb/c小鼠。此外,為進一步明確C5a/C5aR

7、通路在暴發(fā)性肝炎中的作用,我們用C5aR阻斷劑和生理鹽水通過尾靜脈方法注射入Balb/c小鼠體內(nèi),30分鐘后相同條件下對兩組小鼠同時感染MHV-3并觀察兩組小鼠存活及肝臟病損情況,結(jié)果顯示 MHV-3感染后,生理鹽水處理組小鼠死亡率和肝臟壞死水平明顯高于C5aR阻斷劑組,提示補體C5a/C5aR通路參與暴發(fā)性肝炎的發(fā)病。
　　眾所周知,補體的激活通過3條途徑完成,但無論哪一途徑,最終都會級聯(lián)激活C5分子,C5分子隨后裂解成活化片段

8、C5a和C5b發(fā)揮生物學(xué)功能。為明確補體系統(tǒng)在重癥肝炎中是否激活,我們檢測了MHV-3感染Balb/c小鼠72小時及臨床暴發(fā)性肝炎病人補體的活化情況,免疫組化結(jié)果顯示臨床暴發(fā)性肝炎病人和MHV-3感染Balb/c小鼠72小時肝組織切片中,補體C5活化產(chǎn)物C5b-9和補體受體C5aR在肝組織局部大量沉積;定量多聚酶鏈反應(yīng)(PCR,Polymerase chain reaction)和免疫印跡實驗(WB, Western blot)結(jié)果顯示

9、MHV-3感染之后Balb/c小鼠肝組織C5aR表達隨著時間推移呈上升趨勢;外周血酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA,enzyme linked immunology assay)顯示暴發(fā)性肝炎病人和MHV-3感染Balb/c小鼠72小時后補體C5分子活化并有大量活化片段C5a的產(chǎn)生,這些結(jié)果均表明在暴發(fā)性肝炎中補體系統(tǒng)被激活并參與發(fā)病。進一步免疫組化和免疫熒光實驗對 C5aR進行組織定位,發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞中表達 C5aR的主要是肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞

10、。
　　研究表明 MHV-3感染小鼠導(dǎo)致小鼠死亡的原因為纖維蛋白原樣蛋白2/纖維介素(FGL2, Fibrinogen like protein2/fibroleukin)的表達異常,因此我們檢測了MHV-3感染72小時后Balb/c和C5aRKO小鼠血清中FGL2的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C5aRKO小鼠血清中 FGL2的表達明顯低于 Balb/c小鼠組;免疫組化結(jié)果顯示 MHV-3感染72小時后Balb/c小鼠肝組織周圍有大量FGL2及

11、纖維蛋白原沉積,而C5aRKO小鼠肝組織周圍幾乎沒有檢測到 FGL2及纖維蛋白原表達;免疫印跡實驗結(jié)果也顯示 MHV-3感染Balb/c小鼠72小時后肝組織 FGL2表達明顯高于 C5aRKO小鼠。這些結(jié)果均指向C5a/C5aR通路能夠直接調(diào)節(jié)FGL2分子加重暴發(fā)性肝炎的發(fā)病,缺乏C5a/C5aR通路則能明顯減少暴發(fā)性肝炎中FGL2的表達,減輕肝組織損傷,降低小鼠死亡率。
　　通過文獻查閱,我們發(fā)現(xiàn)MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝炎模

12、型中,MAPK信號途徑中的ERK和P38信號通路被激活,而C5a/C5aR通路在其他疾病模型如膿毒癥,急性腦脊髓膜炎中能激活MAPK信號途徑,所以我們推測在MHV-3感染的暴發(fā)型肝炎中,C5a/C5aR通路能激活MAPK信號途徑參與FGL2的調(diào)節(jié)。絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK,Mitogen-activated protein kinase)信號通路在維持細(xì)胞正常生長增值及凋亡中起著重要作用,在急性感染模型中以 ERK和 P38的磷酸

13、化尤為常見。因此,為明確暴發(fā)性肝炎中C5a/C5aR通路的具體機制及其是否通過誘導(dǎo)MAPK信號通路的磷酸化,調(diào)控FGL2的表達導(dǎo)致疾病發(fā)生,我們首先檢測了MHV-3感染不同時間點Balb/c和C5aRKO小鼠肝組織ERK,P38的磷酸化水平,結(jié)果顯示MHV-3感染后,Balb/c小鼠肝組織ERK和P38磷酸化水平高于C5aRKO小鼠;同時檢測病毒感染后兩組小鼠肝組織 FGL2產(chǎn)生時發(fā)現(xiàn) C5aRKO小鼠的 FGL2表達弱于 Balb/c

14、小鼠,提示當(dāng)C5a/C5aR通路被阻斷時小鼠體內(nèi)肝組織磷酸化水平和FGL2的表達下調(diào),明確在此模型中C5a/C5aR通路能夠通過MAPK信號途徑中ERK和P38的磷酸化對FGL2進行調(diào)節(jié)。為更進一步明確 C5a/C5aR通路在暴發(fā)性重癥肝炎中對 FGL2的調(diào)節(jié)作用,我們選取了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7以及Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為研究對象,加以C5a,MHV-3,C5a+MHV-3,C5a+MHV-3+C5aRa作為研究手段對

15、細(xì)胞進行體外刺激,72小時后Western blot檢測ERK,P38的磷酸化水平以及FGL2的表達,結(jié)果顯示C5a能明顯促進MHV-3誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生FGL2的能力,同時C5a也能增強MHV-3誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后ERK和P38的磷酸化水平,這在細(xì)胞層面上為C5a/C5aR通路通過MAPK途徑調(diào)節(jié)FGL2提供可能。最后我們運用ERK和P38抑制劑作為研究手段,提取和培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞后將小鼠巨噬細(xì)胞分為C5a,MHV-3,C5a+MHV-3,