1、目的：
　　 新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischcmic brain damage,HIBD)是各種因為致神經(jīng)細胞變性丟失和組織囊泡化,引起大腦結構及功能受損,導致永久性神經(jīng)功能損傷,引起運動、學習和記憶障礙,從而產(chǎn)生諸多嚴重后遺癥,是導致腦性癱瘓(發(fā)生率為3‰-5‰)的重要因為,近年來隨著新生兒搶救技術的提高,發(fā)病率逐漸增高,而目前的治療方法療效欠佳。迫切需要尋找新的合理有效的治療措施,替代補充損傷的神經(jīng)細胞,改善

2、患者預后。
　　 源于人臍血單個核細胞(human umbilical cord blood mononuclear cellsUBC-MNCs)的神經(jīng)干細胞(neural stem cells NSCs)具有自我更新和多向分化潛能,是未成熟的神經(jīng)前體細胞,在一定條件下可增殖分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞,NSCs移植可替代損傷的神經(jīng)細胞,整合到神經(jīng)回路中,可使受損的神經(jīng)功能得到改善,是有效的細胞重建途徑,是治療HIB

3、D的新理念。
　　 影響NSCs增殖、定向分化的因素非常復雜,可歸結為內(nèi)因和外因兩個方面。內(nèi)因主要是自身基因的調(diào)控,如 Foxg1基因和Nestin基因等,通過激活相關轉(zhuǎn)錄因子,活化或者抑制相關基因的轉(zhuǎn)錄,誘導細胞增殖分化；外因主要是細胞因子和微環(huán)境中外來信號的調(diào)控作用,如hEGF、bFGF和B27因子等,在微環(huán)境中,胞外基質(zhì)的各種成分通過調(diào)節(jié)粘著性和遷移能力,以及結合在胞外基質(zhì)上的各種生長因子和細胞因子間的相互作用,影響NSC

4、s的增殖和分化。
　　 本實驗通過體外培養(yǎng)臍血源性NSCs,研究影響NSCs增殖分化的關鍵調(diào)控因子Nestin及Foxg1的mRNA的表達情況及相互關系,經(jīng)BrdU標記的NSCs經(jīng)靜脈移植到HIBD新生大鼠體內(nèi),從新生大鼠組織學改變、行為學表現(xiàn)和學習記憶能力方面對療效作出評價,探討NSCs移植治療新生鼠HIBD的可行性及時效性,為臨床上NSCs移植治療新生兒HIBD提供更充分的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.

5、采用密度梯度離心法從臍血中分離出UBC-MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasal培養(yǎng)基聯(lián)合誘導其向NSCs方向分化,觀察培養(yǎng)過程中UBC-MNCs增殖分化及形態(tài)學特點,免疫組化法檢測培養(yǎng)細胞中神經(jīng)細胞標志抗原 Nestin、NSE、GFAP蛋白的表達情況；RT-PCR法檢測誘導前后培養(yǎng)細胞中Foxg1和Nestin基因mRNA的表達變化。
　　 2.BrdU標記培養(yǎng)靶細胞并測定細胞增殖指數(shù),標記細胞經(jīng)尾

6、靜脈移植到7d模型HIBD新生大鼠體內(nèi),免疫組化法檢測移植后1d、7d、14d、21d各組動物腦組織易損區(qū)SVZa區(qū)Nestin、NSE、GFAP、BrdU染色陽性細胞表達情況及移植細胞在腦內(nèi)的存活、遷移和分化情況,HE染色作病理學分析。分別于移植后1d、7d、14d、21d進行大鼠神經(jīng)功能評定和Y迷宮試驗,觀察細胞移植對HIBD新生大鼠的治療作用。
　　 結果：
　　 1.臍血單個核細胞可定向誘導分化為神經(jīng)元樣細胞,形

7、成典型NSCs克隆團,表達Nestin、NSE、GFAP標記抗原蛋白,誘導前細胞Nestin、NSE、GFAP的表達均非常低,誘導6d時Nestin陽性細胞數(shù)達高峰,然后開始下降,NSE、GFAP陽性細胞數(shù)逐漸增高。BrdU標記靶細胞陽性率達90％。
　　 2.Foxg1 mRNA和Nestin mRNA在誘導前細胞中低表達,誘導后逐漸升高(P<0.01),6d達高峰,9d、12d時逐漸下降(P<0.05),誘導3d、6d、9d

8、、12d后,Nestin mRNA表達始終較Foxg1 mRNA表達量低。
　　 3.各組動物SVZa區(qū)Nestin陽性細胞表達量早期升高,后期下降,NSCs移植組上升較快,移植后14d時達高峰,后逐漸下降。正常對照組、NSCs移植組SVZa區(qū)NSE陽性細胞表達量總體逐漸升高,其中NSCs移植組升高較快,模型對照組表達逐漸降低。移植后1d,Nestin和NSE陽性細胞表達量各組間比較,P>0.05。SVZa區(qū)GFAP染色陽性細胞

9、表達量逐漸升高,模型組表達最高,NSCs移植組最低；NSCs移植組SVZa區(qū)BrdU表達陽性,BrdU陽性細胞可趨化至左側(cè)SVZa區(qū)并存活,由缺血周圍區(qū)向中央壞死區(qū)遷移,損傷區(qū)面積與模型組相比顯著減小。隨著細胞移植時間延長,BrdU表達不斷增強,P<0.05。
　　 4.與正常對照組相比,HIBD動物的學習記憶能力明顯下降(P<0.05),NSCs移植組與模型組相比,移植后1d大鼠的學習、記憶能力無明顯差異,移植后7d、14d、

10、21d學習記憶能力不斷提高(P<0.05),移植組與模型組相比有顯著差異(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.體外誘導培養(yǎng)可獲得UBC-MNCs源性NSCs,臍血能夠成為NSCs的新來源。
　　 2.Foxg1基因和Nestin基因是NSCs增殖分化的關鍵調(diào)控因子。
　　 3.NSCs移植可促進HIBD新生大鼠SVZa區(qū)結構恢復和細胞功能重建,提高其學習和記憶能力,促進行為功能障礙的恢復。