1、青蒿素是從黃花蒿(ArtemisiaannuaL．)中提取的一種含有過氧橋基團(tuán)結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯，是治療瘧疾的特效藥物。但天然藥源植物黃花蒿中青蒿素含量較低(0.01％～0.6％，DW)，大大限制了商業(yè)化的生產(chǎn)，青蒿素的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國際市場的需求?；瘜W(xué)合成青蒿素，成本高、毒性大不能應(yīng)用于生產(chǎn)。近年來。隨著青蒿素生物合成途徑相關(guān)酶基因的克隆，基因工程成為提高青蒿素含量的有效途徑之一。為研究青蒿素生物合成的分子機(jī)理并為青蒿素代謝工程提供靶

2、點(diǎn)，本研究從黃花蒿中克隆獲得了青蒿素代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因：羥甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因(HDS)和羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶基因(HDR)，并進(jìn)行了相應(yīng)的生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證。為提高青蒿素的含量，本研究還利用基因工程手段，構(gòu)建了三個(gè)植物表達(dá)載體，并將其分別轉(zhuǎn)入黃花蒿中，對(duì)黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究分析。主要結(jié)果如下： HDS催化2-C—甲基赤蘚醇-2,4—環(huán)焦磷酸(ME—cPP)轉(zhuǎn)化生成羥甲基丁烯基-4-磷酸(H

3、MBPP)，是MEP途徑中的一個(gè)必需關(guān)鍵酶。本研究采用RACE技術(shù)，首次從黃花蒿中克隆獲得了HDS基因的cDNA全長序列，并命名為AaHDS(GenBank登錄號(hào)為：FJ479720)。該基因cDNA全長2324bp，包含1854bp的開放式閱讀框(ORF)，編碼617個(gè)氨基酸殘基的蛋白，其電子預(yù)測分子量為68.7KDa，等電點(diǎn)預(yù)測為5.3。生物信息學(xué)分析顯示，AaHDS與來源于其他物種的HDS蛋白序列同源，尤其是與植物來源的HDS高度

4、同源，氨基酸保守一致性高達(dá)80％-95％。AaHDS包含HDS蛋白典型的Cys-270、Cys-273、Cys-305半胱氨酸殘基活性位點(diǎn)，這三個(gè)氨基酸殘基是HDS蛋白催化區(qū)域中最保守的位點(diǎn)。將AaHDS與來源于植物、藻類和細(xì)菌的HDSs構(gòu)建分子發(fā)育樹，結(jié)果表明HDSs在進(jìn)化樹上按照各自所屬類群分為3枝，AaHDS聚到植物的一枝，且與植物甜菊(Steviarebaudiana)HDS親緣關(guān)系最接近。對(duì)AaHDS基因的克隆和分析將會(huì)有助于

5、在分子水平上更好地了解HDS在青蒿素生物合成中的作用。 HDR是青蒿素前體生物合成MEP途徑中的最后一個(gè)催化酶，催化HMBPP轉(zhuǎn)化為異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)(5：1)的混合物。本研究采用RACE技術(shù)，首次從黃花蒿中克隆獲得了HDR基因的全長cDNA，并命名為aaHDR(GenBank登錄號(hào)為：GQ119345)。該基因cDNA全長1640bp，包含1368bp的ORF，編碼455個(gè)氨基酸殘基的蛋

6、白，其電子預(yù)測分子量為51.3KDa，等電點(diǎn)預(yù)測為5.63。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果表明aaHDR與來源于其他植物的HDRs具有很高的同源性，且所有比對(duì)的植物HDR都含有一段質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。對(duì)aaHDR進(jìn)行構(gòu)建分子發(fā)育樹分析，結(jié)果表明HDRs在進(jìn)化樹上按照各自所屬類群分為3枝，AaHDR聚到植物的一枝。AaHDR蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與超嗜熱菌(Aquifexaeolicus)的HDR蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似。功能驗(yàn)證表明，AaHDR能互補(bǔ)突變菌株

7、E．coliMG1655ara◇HDR中缺失的HDR的功能，使突變菌株恢復(fù)生長，證明AaHDR具有典型的HDR的功能。對(duì)AaHDR的克隆分析與功能驗(yàn)證，有助于在分子遺傳學(xué)水平上了解HDR的功能，并對(duì)研究青蒿素前體合成的分子機(jī)理有一定幫助，為青蒿素次生代謝工程提供一個(gè)可能的候選靶點(diǎn)。 鯊烯合酶(SQS)是類異戊二烯代謝途徑支路上的一個(gè)關(guān)鍵酶。本研究利用反義抑制技術(shù)，構(gòu)建SQS的反義表達(dá)載體p1304+—antSQS，調(diào)整代謝流向，

8、使碳流從甾類途徑“分流”或“截流”至青蒿素的代謝方向，從而促進(jìn)青蒿素的生物合成。并將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得了工程菌LBA4404—p1304+—antSQS。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，導(dǎo)入黃花蒿中，經(jīng)PCR鑒定，獲得了12株轉(zhuǎn)antSQS的轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)還研究了濾紙對(duì)黃花蒿叢生芽的誘導(dǎo)及在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，結(jié)果表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中都加鋪一層濾紙，黃花蒿叢生芽的誘導(dǎo)率能得到顯著提高，達(dá)到100％；在篩選培養(yǎng)中加鋪濾紙，能提高黃花

9、蒿抗性叢生芽的產(chǎn)生。這為黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。 青蒿素生物合成所需的IPP前體由MVA途徑和MEP途徑共同提供，已有研究報(bào)道HDR是MEP途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。為了研究HDR在青蒿素生物合成中的作用，進(jìn)而闡明MEP途徑在青蒿素前體合成中的作用。本研究克隆了AaHDR的編碼區(qū)1368bp的片段并命名為cdsHDR和760bp的片段并命名為antHDR，分別正向和反向插入植物表達(dá)載體p1304+的CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止