1、目的:研究甲基潑尼松龍對體外培養(yǎng)許旺細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的促進作用。
　　方法:兩周齡新西蘭大白兔6只處死后,用75％酒精浸泡20min,無菌條件下取雙側(cè)坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng),顯微鏡下仔細剝除神經(jīng)外膜后,將神經(jīng)剪成1 mm3大小,間距1cm種植于預(yù)先鋪過明膠的培養(yǎng)瓶中;7d后傳代,繼續(xù)培養(yǎng)3d后應(yīng)用胰酶消化,聯(lián)合差速貼壁法純化,并S-100蛋白免疫組化染色檢查許旺細胞純度。鑒定過的許旺細胞配成5×104/ml單細胞懸液,每孔1ml加

2、入4孔培養(yǎng)板中。根據(jù)各孔所加入培養(yǎng)液中甲基潑尼松龍濃度的不同進行分組:A孔為對照組,加入含20％小牛血清的雙抗高糖DMEM培養(yǎng)液2ml;B孔中加入含0.1mg/L甲基潑尼松龍的DMEM培養(yǎng)液2ml;C孔中加入含1.0mg/L甲基潑尼松龍的DMEM培養(yǎng)液2ml;D孔中加入含5.0mg/L甲基潑尼松龍的DMEM培養(yǎng)液2ml。將培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分數(shù)為5％的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每天觀察細胞生長情況;每2d用隨即計數(shù)法估算細胞數(shù)。每2d

3、吸出培養(yǎng)液分別存于離心管中并4℃冰箱保存;吸取干凈后,PBS反復(fù)沖洗培養(yǎng)孔,再加入相應(yīng)培養(yǎng)液。將前后兩次計算的細胞數(shù)量分別相減,得出細胞數(shù)量的增加值,應(yīng)用單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)比較。將獲得的20管培養(yǎng)液混勻,三等分后,用ELISA法分別做NGF、CNTF、GDNF定量測定,將前后兩次的測量值分別相減,得出神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌量的增加值,應(yīng)用單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)比較。實驗數(shù)據(jù)采用spss13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理,取P<0.05為差異有統(tǒng)計

4、學(xué)意義。
　　結(jié)果:①B、C、D組許旺細胞生長速度明顯快于A組,三種神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌量明顯多于A組,統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P<0.05),B、C、D組之間無顯著差異(P>0.05);②NGF的檢測結(jié)果有優(yōu)于CNTF、GDNF的趨勢(P<0.01),CNTF和GDNF的促分泌情況無明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:甲基潑尼松龍能直接作用于許旺細胞來促進體外培養(yǎng)許旺細胞的增殖和神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌。甲基潑尼松龍的用量在促進體外培養(yǎng)