1、1．研究目的 研究大理豬源旋毛蟲成蟲（Trichinela spiralis adult worm）三種抗原：排泄分泌抗原（ES）、表面抗原（SA）和蟲體可溶性抗原（BSA）的蛋白組分及其之間的差異，并進一步分析其免疫反應性，為分離和篩選出免疫原性和免疫反應性強的旋毛蟲成蟲抗原成分打基礎。由于旋毛蟲成蟲是旋毛蟲感染的早期階段，腸道是其寄生場所，因此成蟲抗原成分可能作為旋毛蟲病口服疫苗的候選抗原成分，將對旋毛蟲病早期免疫預防和免疫

2、診斷具有實踐意義。 2．研究方法 2．1改良貝氏法收集旋毛蟲成蟲 2．2旋毛蟲成蟲抗原制備:將旋毛蟲成蟲在不含血清的RPMI—1640培養(yǎng)基中于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，離心、收集上清、透析、濃縮后得到排泄分泌抗原（ES）；將旋毛蟲成蟲在含0．25%十六烷基三甲溴化銨（CTAB）及2%脫氧膽酸鈉的RPMI—1640培養(yǎng)基中37℃孵育2．5h，其間搖動培養(yǎng)瓶1次，離心、收集上清、透析、濃縮得到表面抗原（S

3、A）；將旋毛蟲成蟲反復凍融、研磨、超聲粉碎、冷浸、離心，得到蟲體可溶性抗原（BSA）。 2．3制備免疫血清并檢測 2．3．1陰性血清的制備:SD大鼠感染旋毛蟲幼蟲前尾靜脈采血，獲得陰性血清。 2．3．2大鼠抗旋毛蟲血清:用旋毛蟲肌肉幼蟲經(jīng)口感染SD大鼠（8×103條/只），6周后，尾靜脈取血，用旋毛蟲IgG抗體檢測試劑盒檢測感染旋毛蟲大鼠血清IgG抗體效價，嚴格按試劑盒說明書操作，檢測得大鼠血清IgG抗體效價高達

4、1：10240，即可于乙醚麻醉下經(jīng)股動脈取血，室溫靜置30min，3×103r/min離心5min，取上清液即為大鼠抗旋毛蟲血清。分裝，于—20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2．4旋毛蟲成蟲三種抗原的分析以大理豬源旋毛蟲肌肉幼蟲的三種抗原（排泄分泌抗原、表面抗原和蟲體可溶性抗原）作對照，采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE），分別對成蟲三種抗原蛋白成分進行分析；采用蛋白印跡（Western—blot）對成蟲抗原進行免疫反

5、應性分析。 3.結果 3．1旋毛蟲肌幼蟲和成蟲體外培養(yǎng)和收集結果本研究選擇10只成年SD雌性大鼠經(jīng)口食入含約500條旋毛蟲肌肉幼蟲的小鼠肌肉，收集旋毛蟲肌幼蟲40萬條（見圖1）。然后選擇30只成年SD雌性大鼠，每只大鼠經(jīng)口感染8000條旋毛蟲肌肉幼蟲，收集純凈成蟲10萬條，發(fā)現(xiàn)收集的成蟲中雌蟲子宮內充滿新生幼蟲，而且培養(yǎng)液中已有一定新生幼蟲。另外培養(yǎng)液中仍有一定量的雄蟲，表明雄蟲交配后并未很快死亡（見圖2）。 3

6、．2旋毛蟲成蟲抗原的SDS—PAGE分析結果以旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原、表面抗原和蟲體可溶性抗原作對照，對旋毛蟲成蟲排泄分泌抗原、表面抗原和蟲體可溶性抗原經(jīng)SDS—PAGE分析和考馬斯亮藍R—250染色后，可見旋毛蟲成蟲可溶性抗原顯示29條蛋白染色條帶，分子量范圍在112kDa—10kDa之間，其中主帶13條，分子量分別為100、95、81、50、45、43、37、35、30、27、24、20、10kDa；旋毛蟲肌幼蟲蟲體可溶性抗原顯示

7、30條蛋白染色條帶，分子量范圍在100kDa—12kDa之間，其中主帶11條，分子量分別為100、66、63、55、45、40、37、35、30、16、12kDa；旋毛蟲成蟲表面抗原顯示4條主要蛋白染色條帶，分子量分別為50、48、40、34kDa；旋毛蟲肌幼蟲表面抗原顯示10條主要蛋白染色條帶，分子量范圍在105—28kDa之間，分子量分別為105、99、80、63、55、48、35、28、24、21kDa。旋毛蟲成蟲排泄分泌抗原顯示

8、17條蛋白染色條帶，分子量范圍在120—14kDa之間，其中主帶6條，分子量分別為120、64、43、40、35、33kDa；旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原顯示20條蛋白染色條帶，分子量范圍在112—10kDa之間，其中主帶11條，分子量分別為112、66、56、55、53、49、45、43、25、21、10kDa（見圖3） 3．3．3旋毛蟲成蟲抗原Western—blot檢測結果Western—blot檢測結果表明，以大鼠抗旋毛蟲血

9、清檢測時，旋毛蟲成蟲蟲體可溶性抗原可出現(xiàn)13條反應條帶，其中分子量為81、40、37、33、30kDa的條帶著色明顯；旋毛蟲肌肉幼蟲蟲體可溶性抗原可出現(xiàn)25條反應條帶，分子量范圍在80—10kDa之間，其中分子量為75、66、63、55、49、45、37、28、20、16kDa的條帶著色較深；旋毛蟲成蟲表面抗原出現(xiàn)4條反應條帶，其分子量分別為50、48、40、34kDa；旋毛蟲肌幼蟲表面抗原出現(xiàn)7條反應條帶，分子量分別為105、99、8

10、0、55、48、35、28kDa，其中48、35kDa顯色明顯；旋毛蟲成蟲排泄分泌抗原顯示7條反應帶，其分子量分別為43、40、35、27、19、18、14kDa，其中43、40、27、18kDa著色明顯；旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原顯示14條反應帶，其分子量范圍在74—12kDa之間，其中53、49、45、43、35、27、18、12kDa顯色明顯（見圖4）。而陰性血清在相應位置均無特異性反應條帶出現(xiàn)。 4.結論 4．1．

11、旋毛蟲成蟲蟲體可溶性抗原和肌幼蟲蟲體可溶性抗原都含有分子量為45、37、35、30kDa的蛋白組分；旋毛蟲成蟲蟲體可溶性抗原中分子量為81、40、37、33、30kDa的蛋白組分能與大鼠抗旋毛蟲血清抗體IgG發(fā)生較強的特異性識別。 4．2．旋毛蟲成蟲表面抗原與肌幼蟲表面抗原都含有分子量為48kDa的蛋白組分；而且成蟲表面抗原中分子量為50、48、40、34kDa的蛋白組分能與大鼠抗旋毛蟲血清抗體IgG發(fā)生較強的特異性識別。