1、研究目的：
　　 嘗試制備新型MR對比劑長循環(huán)SPIO(Superparamagnetic Iron Oxide)脂質(zhì)體納米微粒,并對其理化性質(zhì)及藥效學(xué)進行測定和初步評價。
　　 材料和方法
　　 1 新型MR對比劑長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒的制備及理化性質(zhì)的測定
　　 1.1長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒的制備
　　 分三步完成:(1)按摩爾比20:1精密稱取一定量DSPG、DSPE-PEG20

2、00,采用薄膜分散法合成長循環(huán)空白脂質(zhì)體納米微粒；(2)采用化學(xué)共沉淀法,在堿性條件下與月桂酸反應(yīng)形成月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒；(3)將上述反應(yīng)產(chǎn)物以一定比例混合,加入TES緩沖液(5mM,PH=7.0),透析3天,過凝膠柱去除過大的脂質(zhì)體及游離的磷脂。
　　 1.2長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒理化性質(zhì)的測定
　　 2 新型MR對比劑長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒藥效學(xué)的初步評價
　　 2.1巨噬細胞的體外吞噬

3、實驗:用含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基于37℃,5％CO2條件下培養(yǎng)RAW264.7細胞24h后,細胞達到80-90％匯合,以0.025％胰酶-0.2％EDTA消化細胞,接種于6孔細胞培養(yǎng)板,5×105個/孔,孵化24小時后,用PBS液洗三遍后,加入含鐵量800μg的空白SPIO和長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體的DMEM全培溶液2ml,孵化24h后,用PBS液洗三遍,以未加入SPIO溶液的細胞作為空白對照,每孔分別加入1ml4％的多聚

4、甲醛溶液,固定20分鐘后,加入由2％亞鐵氰化鉀溶液和2％鹽酸(體積比2:1)混合液1ml,于37℃,孵化30分鐘后,用PBS液洗三遍,倒置顯微鏡下觀察,拍照比較RAW264.7細胞與含上述溶液培養(yǎng)基孵化24h后經(jīng)普魯士藍染色后顏色的差異。
　　 2.2小鼠藥物體內(nèi)分布實驗
　　 2.2.1實驗動物:C57BL/6J雄性小鼠6只,體重12～15g,由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物教研室饋贈,實驗動物符合醫(yī)學(xué)實驗動物標準。<

5、br>　　 2.2.2主要儀器與試劑:石蠟切片機(德國Leica RM2155),Olympus顯微鏡(日本奧林巴斯公司),空白SPIO(南方醫(yī)院影像中心許乙凱教授提供),長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體溶液(按前述方法制備)。
　　 2.2.3動物實驗研究方法:上述6只小鼠,隨機設(shè)為空白對照組(n=2)、空白SPIO組(n=2)、長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體組(n=2)；經(jīng)小鼠尾靜脈分別緩慢注射0.05ml生理鹽水、空白SPIO溶液以及長循環(huán)S

6、PIO脂質(zhì)體溶液(10mgFe/kg)；12小時后行頸椎脫臼法處死動物,快速取其肝臟、脾臟、心臟、肺臟以及腎臟組織,用10％福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,做Perls Prussian-blue染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 2.3荷肺癌裸鼠MR成像實驗
　　 2.3.1實驗動物和瘤株:SPF級4周齡BALB/C雄性裸鼠20只,體重15～19g,按照細胞懸液密度約1×107個/ml,于上述BALB/c裸鼠右側(cè)腋部皮

7、下接種人A549細胞懸液0.2ml,無菌飼養(yǎng)2～3周。
　　 2.3.2實驗動物分組:采用隨機數(shù)字法將其分成兩組:空白SPIO組(n=10)和長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體組(n=10)。
　　 2.3.3 MRI掃描方法:平掃采用膝關(guān)節(jié)線圈,掃描序列參數(shù)如下:FSE-T2WI(TR:4000ms,TE:84.7ms),SE-T1WI(TR:420ms,TE:10.6ms),FOV:10×10cm,層厚1.5mm。平掃結(jié)束后,于上

8、述裸鼠尾靜脈分別注射對比劑空白SPIO以及長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體(10mgFe/kg),并于5min、30min、1h、3h、6h、9h、12h、24h后行T2WI-MR增強掃描,掃描序列及參數(shù)同平掃。掃描結(jié)束后處死裸鼠,分別取兩組腫瘤組織行普魯士藍染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 2.3.4圖像觀察與測量:在T2WI像上測量平掃及增強后兩組實驗動物各時間點肝臟及腫瘤感興趣區(qū)的信號強度及背景噪聲標準差,計算出信噪比,繪制兩組實驗動物

9、平掃及增強后各時間點肝臟及腫瘤的信噪比-時間動態(tài)變化曲線,并計算兩組實驗動物平掃及增強后12h肝臟及腫瘤的信噪比下降百分比。
　　 2.3.5統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包,采用配對樣本t檢驗比較各組動物腫瘤及肝臟平掃和增強后12h信噪比有無差異；采用協(xié)方差分析在扣除各組動物肝臟及腫瘤初始信噪比差異下比較兩組動物肝臟及腫瘤增強12h后信噪比有無顯著性差異。P<0.05認為有顯著性差異。
　　 2.4藥物細胞毒

10、性實驗(MTT法):吸取復(fù)蘇后培養(yǎng)的人肝細胞HL-7702細胞懸液離心洗滌,1000rpm,3min。培養(yǎng)液重懸細胞,細胞計數(shù),以每孔5×103個細胞接種于96孔板中,37℃,5％CO2培養(yǎng)24小時。棄去上清液,用D-hanks液洗兩遍后,分別加入空白SPIO溶液及長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體溶液,濃度分別為每孔鐵含量為10μg,20μg,40μg,80μg,120μg,160μg和200μg的上述納米?；鞈乙汉?0％胎牛血清的培養(yǎng)液200μl

11、,每組設(shè)3個復(fù)孔。另外,以僅含培養(yǎng)基,不含細胞的作為調(diào)零孔；以僅含正常培養(yǎng)細胞的為正常對照孔；以只加入上述納米粒的為樣品對照孔。培養(yǎng)24小時后,加入濃度為5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,每孔20μl,于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化4h后,吸去上清液,每孔加入200μl二甲基亞砜,于平板震蕩儀上震蕩10分鐘,在490nm的波長處于酶標儀中測定吸光度值(OD值),比色時,以空白孔調(diào)零。計算細胞存活率,公式為:細胞存活率=(樣

12、品孔的OD值-樣品對照孔的OD值)/正常對照孔的OD值。
　　 結(jié)論
　　 本文制備的長循環(huán)SPIO脂質(zhì)體納米微粒粒徑大小適宜,分布均勻,在體內(nèi)外均有較好的抗巨噬系統(tǒng)吞噬功能,在體內(nèi)實現(xiàn)了長循環(huán),使SPIO不僅僅局限作用于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),對非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)腫瘤也具有良好的T2負性被動靶向強化效果,另外降低了SPIO對細胞的毒性作用。
　　 不足之處
　　 本文僅是初步研究,局限于新型MR對比劑長循環(huán)SPIO脂

13、質(zhì)體的初步合成及其長循環(huán)功能和被動靶向作用的驗證,藥物制備工藝尚不完善,且未在脂質(zhì)體表面聯(lián)上特異性功能基團(抗體或受體)凸顯其主動靶向作用,這在我們的后續(xù)實驗中將得到進一步體現(xiàn)。
　　 研究目的：
　　 前瞻性研究MR擴散加權(quán)成像在鑒別中央型肺癌與繼發(fā)阻塞性肺實變中的價值。
　　 材料和方法
　　 1 臨床資料:對2009年3月1日～2010年2月21日間經(jīng)病理確診為肺癌的20例符合以下條件的患者行MR胸

14、部掃描:(1)已有影像學(xué)資料(平片、CT或PET-CT)提示肺癌合并肺不張；(2)未接受過放療、化療等抗腫瘤治療；(3)一般情況良好,無嚴重心血管疾病,無肝腎功能障礙,能配合完成MR檢查；(4)體內(nèi)無金屬物(心臟支架、起搏器、心臟人工瓣膜等)或其他MR檢查禁忌。
　　 2 MR掃描方法:采用GE 1.5T超導(dǎo)MR掃描儀,所有病例均行T1-SE、T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA以及DWI各序列的檢查,所有序列均采用外

15、周脈搏及呼吸門控。
　　 3 圖像分析:由2位經(jīng)驗豐富的影像診斷醫(yī)師經(jīng)商議后作出結(jié)論。選擇顯示腫瘤與阻塞性肺實變并存或鄰近的2個相鄰層面作為感興趣區(qū)(region of interest,ROI)所選層面。
　　 彌散圖像測量:在ADC圖上分別測量各個ROI的ADC值,在2種b值的DWI圖像上測量腫瘤與阻塞性肺實變的信號強度平均值、圖像背景噪聲平均值和標準差。計算DWI上病變區(qū)(腫瘤及阻塞性肺實變)的圖像信噪比、腫瘤-阻

16、塞性肺實變的信號強度比和腫瘤-阻塞性肺實變的對比噪聲比。
　　 常規(guī)圖像信號強度測量:采用同樣的方法,在T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA各序列上測量腫瘤及阻塞性肺實變區(qū)的信號強度值,計算相應(yīng)信號強度比。
　　 4 統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS for windows(SPSS13.0)統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計分析。對兩種b值DWI圖像病變區(qū)(包括瘤體與阻塞性實變區(qū))SNR、SIR、CNR的比較,

17、對相同b值不同病變區(qū)ADC值差異,對不同b值時相同病變區(qū)ADC值的差異,DWI與T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA圖像的SIR比較以及不同b值相同病理類型腫瘤瘤體ADC值差異均采用配對樣本t檢驗；對相同b值不同病理類型瘤體ADC值的比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析,多重比較選用LSD法。P<0.05認為有顯著性差異。
　　 結(jié)論
　　 伴有阻塞性肺實變的中央型肺癌其瘤體在DWI上呈明亮高信號,繼發(fā)的阻塞性