1、已有不少實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示HBO治療新生大鼠HIBD的有效時(shí)間窗為6～12 h。然而，臨床上HBO治療新生兒HIE一般要在生后1周左右開始，治療2～3個(gè)療程。有不少報(bào)道用這種方法治療是有效療的。為何HBO治療的時(shí)間窗在實(shí)驗(yàn)研究與臨床實(shí)踐之間有較大的差異呢？其原因尚不清楚。為此我們提出假設(shè)，增加HBO的療程可以延長(zhǎng)其治療的時(shí)間窗。那么，增加HBO的治療時(shí)間或療程后是否能夠增強(qiáng)NSCs的增殖和分化呢？目前國(guó)內(nèi)外的研究都只給1個(gè)療程(5～7次)

2、，甚至1次的HBO治療，尚未見到多療程HBO對(duì)HIBD新生大鼠影響的文獻(xiàn)報(bào)道。如果能夠通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)多療程HBO能夠延長(zhǎng)治療的時(shí)間窗，并提高療效的話，這將為臨床 本研究分為三部分： 第一部分實(shí)驗(yàn)觀察在常規(guī)的治療時(shí)間窗(HIBD后2h)開始多個(gè)療程的HBO治療對(duì)HIBD新生大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的影響。研究結(jié)果顯示了在HIBD后2h給予1個(gè)療程的HBO治療即能夠使神經(jīng)元凋亡減少至接近正常，因此，即使再增加療程也不再顯示對(duì)神經(jīng)元凋

3、亡的抑制作用了。但是對(duì)HIBD新生大鼠行為學(xué)的改善卻隨著療程的增加而增加。這一結(jié)果提示增加HBO的療程可增強(qiáng)對(duì)行為學(xué)損害的保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用的機(jī)制除了減少神經(jīng)元凋亡以外，可能還存在著其它原因。根據(jù)我們最近的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBO治療可促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖與分化[余小河，2004;王曉莉，2007；Yang YJ，2008]，為此我們提出假設(shè)，增加HBO療程能夠增強(qiáng)對(duì)行為學(xué)損害的保護(hù)作用的機(jī)制與增強(qiáng)了促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增

4、殖與分化的作用有關(guān)。在這基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了第二部分實(shí)驗(yàn)。 第二部分實(shí)驗(yàn)觀察了在常規(guī)的治療時(shí)間窗(HIBD后2h)開始多個(gè)療程的HBO治療對(duì)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖與分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了增加HBO療程確實(shí)可增強(qiáng)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖，并分化為神經(jīng)元。有了這一結(jié)果，進(jìn)一步我們就可以開始探討延長(zhǎng)HBO治療時(shí)間窗后，是否可通過增加療程來提高療效。 第三部分實(shí)驗(yàn)主要探討在HIBD后48 h和96 h開始不同療程

5、的HBO治療對(duì)HIBD新生大鼠有否保護(hù)作用。結(jié)果是肯定的，證明了即使是長(zhǎng)達(dá)96 h的時(shí)間窗開始HBO治療，通過增加療程也可獲得明顯的保護(hù)作用。 各部分的具體內(nèi)容如下。 一、不同療程HBO對(duì)HIBD新生大鼠行為學(xué)及組織學(xué)的影響 目的:通過觀察多療程HBO治療對(duì)HIBD新生大鼠腦部病變和遠(yuǎn)期行為學(xué)的影響，探討增加HBO的療程是否能夠提高其療效。 方法:7日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為5組

6、：1)正常對(duì)照組(CON，n=10)，2)缺氧缺血腦損傷組(HIBD，n=10)，3)高壓氧1療程組(HBO-1，n=10)，4)高壓氧2療程組(HB0-2，n=10)，5)高壓氧3療程組(HB0-3，n=10)。HIBD組按照Rice-Vannucci方法制作新生大鼠HIBD模型。高壓氧治療組在HIBD模型制成后2小時(shí)開始治療，艙內(nèi)壓力2 ATA，穩(wěn)壓60 min，每日1次，7次為1個(gè)療程。休息3天再進(jìn)行下一個(gè)療程。療程結(jié)束后，各組均

7、等到鼠齡35天時(shí)進(jìn)行T迷宮試驗(yàn)、放射臂迷宮試驗(yàn)、足錯(cuò)誤等行為學(xué)測(cè)試。測(cè)試完成后(鼠齡46天)處死動(dòng)物，10％水合氯醛麻醉后打開胸腔，于心尖部插管注入生理鹽水，待流出液清亮后，再注入4％多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，取出左側(cè)大腦半球用4％多聚甲醛固定24h后石蠟包埋、固定、脫水后，切片機(jī)在前囟前1.0至-0.8mm冠狀位連續(xù)切片，片厚4μm，行TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡和尼氏染色觀察腦組織病理改變。 結(jié)果:(1) HBO組行為學(xué)測(cè)

8、試結(jié)果優(yōu)于HIBD組；(2)T迷宮測(cè)試中，隨著天數(shù)的增加，正常組和HBO組的正確率逐漸增高；而且隨著HBO療程的增加，正確率逐漸增加，訓(xùn)練至第3天時(shí)，HB0-3組正確率明顯高于HBO-1(P<0.05)。(3)放射臂迷宮測(cè)試中，隨著HBO療程的增加，覓水時(shí)間逐漸減少，HB0-3組所需時(shí)間明顯少于HBO-1和HB0-2組(P<0.01)；隨著HBO療程的增加，平均錯(cuò)誤次數(shù)和重復(fù)次數(shù)逐漸減少，其中HB0-3組重復(fù)次數(shù)明顯低于HBO-1和HB

9、0-2組(P<0.01)。(4)足錯(cuò)誤測(cè)試中，HIBD組右左差值較對(duì)照組、HB0-2、HB0-3組高(P<0.05)，隨著HBO療程的增加，足錯(cuò)誤次數(shù)減少。(4)TUNEL染色顯示HBO治療可抑制HIBD新生大鼠皮層神經(jīng)元凋亡，但各療程組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)尼氏染色顯示HBO治療可使皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失較HIBD組顯著減少，但各療程組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論:(1)在短時(shí)間窗(2h)開始HBO治療，對(duì)HIBD

10、新生大鼠行為學(xué)損害的保護(hù)作用隨著療程增加而增加。(2)在短時(shí)間窗(2h)開始一個(gè)療程HBO治療，已經(jīng)能夠明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，增加療程不再加強(qiáng)這一作用。 二、不同療程HBO對(duì)HIBD新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的影響 目的:第一部分的研究結(jié)果顯示了在HIBD后2h給予1個(gè)療程的HBO治療即能夠明顯抑制神經(jīng)元凋亡，再增加療程已無法顯示抗凋亡作用的繼續(xù)增強(qiáng)。但是隨著療程的增加，HBO對(duì)HIBD新生大鼠遠(yuǎn)期行為學(xué)的改善更為明

11、顯。為此我們推測(cè)是否增加HBO的療程可通過刺激內(nèi)源性NSCs的增殖和分化來加強(qiáng)對(duì)行為學(xué)損傷的保護(hù)作用的。因此，本研究通過觀察增加HBO療程是否能夠增強(qiáng)刺激HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖和分化。 方法:7日齡SD大鼠隨機(jī)分為5組：1)正常對(duì)照組(CON，n=20)，2)缺氧缺血腦損傷組(HIBD，n=20)，3)高壓氧1療程組(HBO-1，n=20)，4)高壓氧2療程組(HB0-2，n=20)，5)高壓氧3療程組( HB0-

12、3，n=20)。HIBD模型制作與HBO治療方法同第一部分。每組各取10只動(dòng)物在第三個(gè)療程完成前48小時(shí)(即鼠齡33天時(shí))腹腔注射BrdU(每次50 mg/kg，每8小時(shí)注射1次，連續(xù)5次)。各組動(dòng)物均等到鼠齡35天時(shí)處死(方法同第一部分)取腦組織切片，采用BrdU/Nestin免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)缺血側(cè)側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ區(qū))和海馬齒狀回(DG區(qū))的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的變化；免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)大腦皮層BrdU/NSE和BrdU/GFA

13、P陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)每組另外的10只動(dòng)物用10％水合氯醛麻醉后斷頭處死，取缺血側(cè)大腦半球全層腦組織約lOOmg，采用Western blot法檢測(cè)缺血側(cè)大腦半球nestin總蛋白的變化。 結(jié)論: HIBD后2小時(shí)給予HBO治療，通過增加HBO療程可促進(jìn)HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖，并分化為神經(jīng)元。 三、增加HBO療程對(duì)延遲治療時(shí)間窗的新生大鼠HIBD療效觀察 目的:已有不少實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示HBO治療新生大

14、鼠HIBD的有效時(shí)間窗為6～12 h。然而，臨床上HBO治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy. HIE)一般要在生后1周左右開始，治療2～3個(gè)療程。有不少報(bào)道用這種方法治療是有效療的。為何HBO治療的時(shí)間窗在實(shí)驗(yàn)研究與臨床實(shí)踐之間有較大的差異原因不清楚。根據(jù)我們前面的研究結(jié)果，在HIBD后2小時(shí)開始給予一個(gè)療程的HBO即可有效地抑制神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用。那么在時(shí)間窗廷

15、遲時(shí)，增加HBO療程是否也能夠?qū)p傷的神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用呢？為此我們提出假設(shè)，增加HBO的療程可以延長(zhǎng)其治療的時(shí)間窗。本研究旨在探討多療程的HBO治療是否對(duì)96 h的時(shí)間窗的HIBD新生大鼠有保護(hù)作用。增加HBO療程能夠更好地減輕HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 方法:7日齡SD大鼠(88只)，隨機(jī)分為11個(gè)組(n=8)，包括正常對(duì)照組(CON)、缺氧缺血腦損傷組(HIBD)和高壓氧組(HBO)；HBO組根據(jù)HBO不同時(shí)間窗分為

16、2h高壓氧組(2H，在HIBD后2h開始給予HBO)、48h高壓氧組(48H，HIBD后48h給予HBO)及96h高壓氧組(96H，HIBD后96h給予HBO)等三個(gè)亞組；各亞組又根據(jù)不同療程分成一療程組( HBO-1)、二療程(HB0-2)和三療程組(HB0-3)等組。各組在HBO療程完成后置于空氣中喂養(yǎng)，待96H的三療程組完成全部療程后，即鼠齡38天(HIBD后31天)時(shí)一同處死，采用TUNEL染色檢測(cè)各組大腦皮層和海馬CA1區(qū)凋亡

17、；并采用NSE免疫組化方法檢測(cè)各組皮層神經(jīng)元數(shù)量。 結(jié)論:(1) HIBD后2小時(shí)給予一療程的HBO治療即可明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及保護(hù)神經(jīng)元；(2)隨著HBO開始治療的時(shí)間窗的延遲，一個(gè)療程的HBO對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用逐漸減弱，但通過增加療程可增強(qiáng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制與對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。 綜上所述，本研究結(jié)論如下： 1、HIBD后2小時(shí)給予HBO可對(duì)HIBD新生大鼠的遠(yuǎn)期腦功能有修復(fù)作用。而且隨著HBO療