1、目的：觀察比較SD大鼠在骨折合并腦外傷以及在單純骨折時(shí)，骨折愈合的過程中骨痂內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的表達(dá)變化；探討VEGF在大鼠骨折合并腦外傷后的骨折加速愈合中的作用機(jī)制，以期為臨床選擇性地應(yīng)用VEGF基因療法治療難治性骨折提供理論依據(jù)。 方法：SD大鼠66只分為3組：正常對照組(N)6只，骨折組(F)30只，骨折合并腦外傷組(TBI+F)30只。 腦外傷模型采用改進(jìn)的Marmarou自由落體裝置撞擊大鼠顱骨制作

2、彌漫性中度腦損傷模型。骨折模型制造方法：于左側(cè)下肢膝關(guān)節(jié)處縱向剪開皮膚，暴露并剝離膝關(guān)節(jié)韌帶，在脛骨髁間處鉆孔，沿髓腔方向插入直徑約25mm的無菌克氏鋼針。在脛骨中上1/3處鈍性剝離肌肉筋膜，橫向折斷脛骨，逐層關(guān)閉切口。 SD大鼠編號稱重后，10％ZK合氯醛腹腔注射(3ml/kg)，麻醉生效后固定于特制手術(shù)臺上，手術(shù)過程均在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行，術(shù)后放置于籠中自由活動、隨意進(jìn)食水。 F組和TBI+F組動物，分別于術(shù)后第3d

3、、7d、14d、24d、42 d各處死6只進(jìn)行X線攝片，以觀察骨折修復(fù)過程和效果。并在距離骨折斷端大約1cm處截取骨痂標(biāo)本，取其中一半迅速去除軟組織，用冷生理鹽水沖凈血液后置液氮中保存，用于RT-PCR檢測。一半組織用于光鏡觀察和免疫組化染色。 結(jié)果： 1 X線觀察 1.1 F組：骨折后3、7、14d骨折線清晰，未見骨痂形成；24d骨折線較清晰，有骨痂形成，量較少；42d骨折線模糊，仍隱約可見，骨折周圍有大量

4、骨痂形成。 1.2 TBI+F組：骨折后3、7d骨折線清晰，未見骨痂形成；14d骨折線較清晰，可見少量骨痂形成；24d骨折線變得模糊，骨折周圍有較多骨痂形成；42d骨折線消失，傷肢已基本愈合，骨折周圍可見大量骨性骨痂形成，局部增粗，骨密度較高。 2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測 2．1 F組骨折后3d，未見到有明顯VEGF的表達(dá)；在骨折后7d開始出現(xiàn)VEGF的表達(dá)且此后表達(dá)持續(xù)至24d時(shí)，至42d已

5、經(jīng)見不到VEGF的表達(dá)。 2．2 TBI+F組骨折后3d即開始出現(xiàn)VEGF的表達(dá)，此后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，持續(xù)到24d。至42d已經(jīng)見不到VEGF的表達(dá)。 3 光鏡觀察 3.1 F組骨折后3d，骨折端可見到少量肉芽組織形成；7d時(shí)可見到肉芽組織長入骨折端，并有軟骨細(xì)胞形成；14d可見新生骨小梁形成；24d后，骨小梁開始相互連接；骨折后42d骨小梁逐漸開始塑形，向板層骨轉(zhuǎn)化。 3.2 TBI+F組骨折后3d

6、，骨折端可見肉芽組織形成：骨折后7d，肉芽組織長入骨折端，并有軟骨形成，個(gè)別可見到新生骨小梁形成；骨折后14d可見新生骨小梁形成；骨折后24d骨小梁開始相互連接、塑形；骨折后42d骨小梁開始向板層骨轉(zhuǎn)化。 4 免疫組織化學(xué)染色 4．1 F組骨折后3d，骨折端少量肉芽組織內(nèi)偶爾可見到VEGF陽性染色細(xì)胞；骨折后7d骨折端骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和肉芽組織內(nèi)纖維母細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF呈陽性染色，新形成的軟骨基質(zhì)VEGF呈陽

7、性染色；骨折后14dVEGF在成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均呈強(qiáng)陽性染色；骨折后24d，在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF呈陽性表達(dá)；骨折后42d，VEGF僅在部分軟骨細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有陽性染色。 4．2 TBI+F組骨折后3d骨折端肉芽組織內(nèi)可見部分細(xì)胞呈VEGF陽性；骨折后7d骨折端骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和纖維母細(xì)胞和新形成的軟骨基質(zhì)VEGF呈陽性染色，肉芽組織中纖維母細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF亦呈陽性染色；骨折后14d

8、VEGF在成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肥大的軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均呈強(qiáng)陽性染色；骨折后24d在成熟軟骨細(xì)胞、肥大軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF呈陽性表達(dá)；骨折后42dVEGF僅在部分軟骨細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有陽性染色。 5 圖像分析表明：F組VEGF表達(dá)從7d開始出現(xiàn)，持續(xù)到3周左右達(dá)高峰：TBI+F組VEGF表達(dá)3d開始出現(xiàn)，2周達(dá)高峰，并持續(xù)到3周左右。在3、7d時(shí)，TBI+F組VEGF表達(dá)較F組顯著增高，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義；在14d時(shí)，TBI+F組VEGF表達(dá)較F組增高，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；至24d時(shí)，TBI+F組和F組VEG-F表達(dá)無明顯區(qū)別，P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；至42d時(shí)，兩組均無表達(dá)。 結(jié)論： 1 骨折愈合過程需要多因子參與、協(xié)調(diào)，VEGF有可能是作為骨折愈合過程中的一種重要因子在發(fā)揮作用。 2 單純骨折后3周左右為VEGF表達(dá)的高峰期；中樞神經(jīng)損傷合并骨折后2-3周為VEGF表達(dá)的高峰期，其表達(dá)高峰