1、背景與目的:
　　硒是人體生長發(fā)育必需的微量元素,在生命活動中有著非常重要的作用。缺硒會引起含硒酶活性降低,氧自由基清除受阻、生物膜損傷、解毒和免疫功能減退等一系列機體功能障礙。缺硒還很可能影響腦的發(fā)育。缺碘性弱智兒童的出生要求我們搞清楚在二十多年全民補碘后的今天,碘因素基本去除后,缺硒是否為另一個影響智力發(fā)育的重要因素?硒對神經(jīng)細胞分化發(fā)育的影響越來越引起學者們的重視。已有研究發(fā)現(xiàn):硒能促進神經(jīng)細胞體外存活和發(fā)育,但硒在體內(nèi)對腦

2、形態(tài)發(fā)育有什么影響?硒碘聯(lián)合缺乏的影響又如何?還未見報道。本實驗利用已成功建立的低硒、低碘大鼠模型第三代動物,取生后第4天、21天的大腦標本,通過HE、Nissl(甲苯胺藍)、PAS染色,體視學測量、免疫組化和Western Blot蛋白免疫印跡方法對生后大鼠腦,特別是海馬的形態(tài)發(fā)育改變、神經(jīng)細胞分化成熟蛋白---膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP,星形膠質(zhì)細胞)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE,神經(jīng)元)、2’,3’-環(huán)核甘酸3磷酸二酯酶(CNP

3、ase少突膠質(zhì)細胞)以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達進行了實驗研究。
　　材料和方法:
　　利用已成功建立并繁殖至第三代的動物模型,實驗分四組:低硒組、低碘組、低硒低碘組和對照組(補硒補碘組)。大鼠分別在生后第4天、第21天取腦。第4天的大鼠每組取4例腦標本,固定---包埋--切片,行HE、Nissl和GFAP染色做一般普通光鏡觀察。第21天的大鼠每組取6例腦標本,固定、包埋后切片,做HE、Nissl、PAS染色,鏡下

4、觀察并對海馬區(qū)進行體視學的細胞測量;神經(jīng)細胞分化成熟蛋白GFAP、NSE、CNPase和BDNF行免疫組化染色;光鏡下陽性細胞記數(shù)并進行陽性染色強度的圖象分析。此外,每組另取4例新鮮腦組織,提取總蛋白做Western Blot免疫印跡檢測GFAP、NSE、CNPase、BDNF蛋白的表達。
　　結果:
　　1、形態(tài)學觀察:
　　P4HE、Nissl染色切片觀察,與對照組比較,低硒組、低碘組和低硒低碘組大腦皮層的層狀結構

5、模糊不清,海馬齒狀回(DG)內(nèi)臂細胞發(fā)育延遲呈 L型;到了P21,皮層細胞密度增加,排列擁擠,海馬各區(qū)也都存在不同程度的細胞數(shù)量增加,排列極性差,有多量糖原在細胞內(nèi)堆積。低碘和低硒低碘組的改變比低硒組明顯。
　　2、海馬體視學觀察:
　　體視學參數(shù):核體密度(Vv)、表面積密度(Sv)、形狀因子(SF)、核漿比(N/P)能夠用來評價細胞的發(fā)育成熟狀況,Vv可以衡量細胞的密度,一般數(shù)值越小說明細胞密度低,反之細胞密度越高;Sv

6、、SF是和細胞形狀相關的指標,Sv越大SF越小說明細胞的形狀越不規(guī)則,更趨多形性,反之細胞越接近圓形;N/P可以評價細胞發(fā)育狀況,分化越差,比值越高,分化越成熟越低。我們的觀察結果發(fā)現(xiàn):在CA1區(qū),各實驗組與對照組比較,實驗組的Vv、SF、N/P都增大,低硒低碘組最大(P<0.01),低碘組次之(P<0.05),而低硒組的SF、N/P也比對照組大(P<0.01),Vv則沒有差別。Sv參數(shù)各實驗組和對照組比較偏小,三組中低硒組最高,低碘組

7、次之,低硒低碘最低(P<0.01)。在CA3區(qū),各實驗組和對照組比較,實驗組Vv、SF、N/P都增大,低硒低碘組最大(P<0.01),低碘組次之(P<0.01),低硒組也高于對照組(P<0.01);而Sv這個參數(shù),和對照比較,各實驗組也都減小,低硒低碘最明顯(P<0.01),低碘組次之(P<0.05),低硒組相比無差異。在DG區(qū),各實驗組和對照組比較,Vv、SF、N/P都有增大的趨勢,SF、N/P低硒低碘組最高(P<0.01),而低碘組

8、次之(P<0.01),低硒第三(P<0.01),而Vv、Sv在各組之間沒有統(tǒng)計學差異。DG厚度和層數(shù)在低硒、低碘組都增加,比對照組增厚、增多。低硒低碘組則不明顯。結果提示低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏導致海馬細胞發(fā)育落后。
　　3、神經(jīng)細胞分化成熟蛋白的表達結果:
　　1)星形膠質(zhì)細胞標記蛋白GFAP陽性細胞表達數(shù)和陽性灰度值:在CA1、DG區(qū),對照組明顯高于其余三組(P<0.01)。在CA3區(qū),對照組比低硒組、低碘低硒組也表達增

9、高,統(tǒng)計學有顯著性差異(p<0.01),但與低碘組則無差異。Western Blot免疫印記結果也顯示對照組的表達高于其它組。結果提示:硒碘缺乏使星形膠質(zhì)細胞的表達有下降的趨勢,低硒影響較大。2)神經(jīng)元標記成熟蛋白NSE灰度分析:對照組陽性細胞灰度值比低碘組、低硒低碘組高(P<0.01);低硒組也高于低碘組和低硒低碘組(P<0.01)。低硒組和對照組無差異。Western Blot免疫印記結果也顯示各組之間存在差別,和免疫組化的結果相符

10、。結果提示:單純低硒對 NSE表達的影響不明顯,低碘和硒碘聯(lián)合缺乏可使NSE表達明顯下降。3)少突膠質(zhì)細胞標記成熟蛋白CNPase結果觀察:CNPase陽性產(chǎn)物在各組的皮層、海馬都有分布。通過對海馬CA3區(qū)錐體細胞層內(nèi)少突膠質(zhì)細胞計數(shù),發(fā)現(xiàn)CNPase陽性少突膠質(zhì)細胞在低碘組和低硒低碘組的數(shù)量增加,明顯較對照組、低硒組高;在皮層的陽性纖維染色深,分布范圍也較廣。結果提示:低碘和硒碘聯(lián)合缺乏可使海馬少突膠質(zhì)細胞數(shù)量增加,其結果可能使其與神

11、經(jīng)元的匹配不協(xié)調(diào)。從而可能抑制中樞神經(jīng)元神經(jīng)纖維的生長進而來影響海馬錐體細胞的功能。
　　4、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達:
　　BDNF免疫組化染色陽性產(chǎn)物在海馬、皮層和中腦都有表達,在海馬本體,對照組陽性灰度強度明顯高于低硒組(P<0.05)和低硒低碘組(P<0.01),但和低碘組比較無統(tǒng)計學差異,DG區(qū)BDNF陽性灰度值在各組之間不存在差異。但在上述兩區(qū)低碘組灰度強度都高于低硒組,低硒低碘組最低;Western B

12、lot蛋白免疫印記則顯示低碘組較其它組表達增強。結果提示:低硒影響海馬BDNF的表達,硒碘聯(lián)合缺乏其表達量更低。
　　結論:
　　(1)從體視學的Vv、Sv、SF、N/P參數(shù)分析和鏡下形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏都能不同程度地影響大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細胞的形態(tài)發(fā)育,而且,聯(lián)合缺乏還有一定的加合作用。
　　(2)低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏可使海馬神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的分化成熟標記蛋白NSE、GFAP、CN

13、Pase都出現(xiàn)不同程度的改變。與對照組比較,低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏都使GFAP、NSE表達下降,低硒主要影響星形膠質(zhì)細胞的GFAP的表達,低碘則影響神經(jīng)元 NSE的表達。與對照組比較低碘和硒碘聯(lián)合缺乏CNPase表達升高,提示低碘能刺激少突膠質(zhì)細胞的增生。低硒則影響不明顯。
　　(3)和對照組比較,硒碘聯(lián)合缺乏引起B(yǎng)DNF在海馬表達的下降,單純低硒也使海馬的BDNF表達下降,但單純低碘影響不明顯,提示兩者可能通過不同的機制影響其