1、目的:毛囊是一種哺乳動物特有的結構復雜的皮膚附屬器官，富含干細胞，由神經(jīng)外胚層和中胚層交互作用形成的一個典型再生系統(tǒng)，它能誘導毛干和毛纖維的產(chǎn)生，其主要包含來源于間充質(zhì)的毛乳頭細胞(Dermalpapilla cells，DPCs)及真皮鞘細胞。毛乳頭細胞位于毛囊基地部，體內(nèi)外誘導毛囊形成及促進毛發(fā)生長是其最重要的生物學特性，并在毛囊的發(fā)生、發(fā)展和周期性循環(huán)中起主導作用，且體內(nèi)外誘導毛囊形成及促進毛發(fā)生長是DPCs最重要的生物學功能。但

2、是研究表明只有早期DPCs具有毛囊誘導能力，晚期DPCs細胞則失去這種功能。體外培養(yǎng)早期DPCs展現(xiàn)出凝集性生長特性，但隨著傳代次數(shù)不斷增加，細胞逐漸衰老，這一特性也逐漸喪失。因此，研究者認為DPCs凝集性生長特性可能與其誘導毛囊形成的生物學功能有關。目前對于體外培養(yǎng)的DPCs逐漸喪失凝集性生長特性及生物學功能的原因及機制尚不清楚，值得進一步研究。細胞衰老即細胞過于老化時，可抑制細胞分裂并導致細胞自然死亡過程。研究認為P21(即CDKN

3、1A)作為細胞周期蛋白激酶的廣譜抑制因子能夠誘導細胞老化的多效性調(diào)節(jié)劑-酰胺酶，并影響細胞衰老的許多過程，是細胞衰老過程中的關鍵基因。本實驗通過腺病毒感染DPCs來沉默P21基因，并檢測細胞的形態(tài)、增殖、周期及凋亡等變化情況，以研究P21在DPCs中的表達及其作用，并探索P21與其生物學功能是否有相關性。
　　方法:
　　1實驗分組:
　　正常組:常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　陰性對照組:用腺病毒HK-1p2 shRNA，

4、即空載體腺病毒感染DPCs，以排除空載體腺病毒本身的干擾。
　　陽性對照組:用腺病毒CDKN1 A-1 p2 shRNA，即沉默P21基因的腺病毒感染DPCs。
　　2毛乳頭細胞的培養(yǎng)及腺病素轉染。將三組毛乳頭細胞一同培養(yǎng)于MSCM培養(yǎng)基中，置于溫箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。并應用熒光顯微鏡檢測腺病毒轉染效率。
　　3對比三組毛乳頭細胞的形態(tài)改變及生物學功能。
　　4應用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。
　　5應用MTT的方法繪制

5、細胞的生長曲線。
　　6應用流式細胞術檢測細胞的細胞周期及凋亡。
　　7應用流式細胞術、免疫組化及免疫熒光三種方法檢測P21蛋白在細胞中的表達情況。
　　8應用反轉錄PCR及實時熒光定量PCR的方法檢測細胞中P21基因mRNA的表達情況。
　　9應用SPSS16.0，以α=0.05的檢驗標準對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及處理。
　　結果:
　　1體外成功培養(yǎng)人毛乳頭細胞至13代，人毛乳頭細胞腺病毒轉染HK-1p

6、2 shRNA和CDKN1A-1p2 shRNA的轉染效率達到80-90％。
　　2正常組:低代次細胞展現(xiàn)明顯的凝集性生長特性，8代開始消失，隨著傳代次數(shù)增加，細胞體積變大，形態(tài)變不規(guī)則，胞質(zhì)顆粒增多;同代次陰性對照組細胞凝集性生長特性及細胞形態(tài)無明顯變化;同代次陽性對照組細胞凝集性生長惡性無明顯變化，但細胞體積稍變大，胞質(zhì)顆粒增多。
　　3掃描電鏡中陽性對照組細胞的細胞核核分葉增多，核顆粒增多。
　　4 MTT法繪制

7、三種毛乳頭細胞的生長曲線顯示:正常組中4、7、10及12代細胞生長速度依次減慢，而同代次陽性對照組細胞較正常組細胞生長速度增快。
　　5流式細胞術檢測毛乳頭細胞的細胞周期及凋亡。
　　細胞G1期比例用百分比表示，細胞凋亡用％Gated值表示。流式結果顯示:正常組4代、7代及10代毛乳頭細胞G1期比例分別為:39.7667％±6.7575％、53.9667％±3.0271％及61.4667％±0.6028％，細胞凋亡率分別為:

8、2.12±0.4232、5.6433±1.3503及10.54±2.1345;而5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞的G1期比例分別為:47.9333％±9.7285％、51.7％±7.494％及40.1％±6.3095％，凋亡率分別是:3.3767±0.8769、7.3567±0.4387及12.3233±1.769;8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞的G1期比例分別為:55.5333％±1.9858％、58.8667％±4.6

9、801％及44.9667％±7.9689％，凋亡率分別是:9.4067±0.9463、13.6967±0.8838及17.9567±3.2875。
　　6流失細胞術檢測毛乳頭細胞P21蛋白的表達量用熒光指數(shù)(FI)表示，流式結果示:正常組4、7、10代毛乳頭細胞中P21蛋白的FI值分別為:2.0825±0.1923、2.4945±0.135、2.8298±0.071;5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21蛋白的FI值分別為

10、:2.2546±0.0363、2.35±0.127及2.0278±0.1443;8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21蛋白的FI值分別為:2.5947±0.1184、2.683±0.1984及2.4019±0.1048。
　　免疫組化的結果顯示P21蛋白定位于毛乳頭細胞的細胞核及細胞質(zhì)，而陽性對照組毛乳頭細胞P21蛋白定位于細胞核及核周圍區(qū)域。
　　免疫熒光的結果顯示正常組10代毛乳頭細胞胞質(zhì)內(nèi)P21蛋白表達量明顯多

11、于4代及7代細胞。
　　7反轉錄PCR結果顯示陽性對照組毛乳頭細胞的P21基因mRNA表達降低;實時熒光定量PCR結果示:正常組4、7、10代毛乳頭細胞P21基因mRNA表達量分別為:1、4.8787±0.8342及33.2018±2，536;5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21基因mRNA表達量分別為:1、2.7617±0.9544及0.0609±0.0342;8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細胞中P21基因mRNA