1、目的：上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一[1]，因缺乏早期診斷方法，五年生存率在3096左右[2-5]。腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類和紫杉醇類為基礎(chǔ)的化療是EOC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，可大大改善卵巢癌患者的預(yù)后[6-10]。但所有鉑類藥物均能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，骨髓抑制是最常見的化療副反應(yīng)之一。骨髓抑制嚴(yán)重時可出現(xiàn)繼發(fā)感染、出血、甚至藥物性再生障礙性貧血，是不良預(yù)后的危險

2、因素之一。另外，卵巢癌術(shù)后化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)是卵巢癌治療中又一棘手問題[11，12]。一半以上患者死于化療的毒副作用和腫瘤的耐藥復(fù)發(fā)[6，13]，因此尋找低毒高效的化療藥物可能成為解決卵巢癌復(fù)發(fā)和耐藥的有效手段，對改善患者預(yù)后和提高生活質(zhì)量有重要的臨床意義。
　　 倍半萜烯內(nèi)酯類化合物是從植物中提取的一類天然倍半萜類化合物，廣泛存在于菊科、傘形科、大戟科、衛(wèi)茅科、豆科、葫蘆科和毛莨科中，大多具有一定的生物活性，如抗腫瘤、強心、抗

3、瘧、抗菌、抗急慢性炎癥等[14]。目前對此類物質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向了抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面。Bigelovin屬于倍半萜烯內(nèi)酯類化合物，在菊科植物中含量很高。研究發(fā)現(xiàn)bigelovin在體外可抑制人類肺癌、激素依賴性前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的生長，且對耐長春堿的上皮性癌細胞系具有很強的細胞毒作用[15-17]，國內(nèi)外關(guān)于bigelovin對人上皮性卵巢癌順鉑耐藥細胞及正常二倍體細胞的作用尚未見報道。
　　 本實驗通過體外觀察bi

4、gelovin對人卵巢漿液性囊腺癌細胞株(SK-OV-3)、人卵巢漿液性囊腺癌順鉑耐藥細胞株(SK-OV-3/DDP)和外周血單個核細胞(PBMC)增殖及細胞周期的影響，旨在尋找低毒高效的卵巢癌化療藥物，為克服卵巢癌化療的毒副反應(yīng)和耐藥提供實驗依據(jù)，為抗卵巢癌藥物的體外篩選提供科學(xué)的實驗設(shè)計思路和實驗方法。
　　 方法：
　　 1、體外培養(yǎng)SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細胞株：將細胞置于37℃，飽和濕度，5％CO

5、2，含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期時用于實驗。
　　 2、密度梯度離心法分離并培養(yǎng)PBMC細胞：無菌采集正常肘靜脈肝素抗凝血，D-PBS溶液等比稀釋后，加入淋巴細胞分離液面離心，取中間白膜層洗滌兩次，用含20％FBS、2％植物血凝素(PHA)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，臺盼藍排斥試驗觀察細胞活力。培養(yǎng)24h后，用不含PHA的新鮮培養(yǎng)液接種細胞于96孔板中，靜置2h后加藥觀察。

6、
　　 3、倒置顯微鏡觀察：用不同濃度bigelovin作用于SK-OV-3、SK-OV-3/DDP和PBMC細胞，在倒置相差顯微鏡下定時觀察細胞的生長情況。
　　 4、MTT比色試驗法
　　 4.1選擇不同觀察時間細胞的最佳接種密度：觀察在含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液200μ L條件下，分別以1×104/mL、2×104/mL、3×104/mL、4×104/mL、5×104/mL、6×104/mL、

7、7×104/mL、8×104/mL密度接種的SK-OV-3、SK-OV-3/DDP貼壁后24h、48h、72h的生長狀況，繪制接種密度-吸光度(OD值)曲線，選擇各觀察時間細胞的最佳接種密度。
　　 4.2選擇細胞的最佳接種方式：以8 mg/L順鉑(DDP)作用于SK-OV-3細胞為例，在同一96孔板中接種1.5×104/mL、3×104/mL、6×104/mL三種密度的SK-OV-3細胞，細胞貼壁后每孔加入等量DDP，使終濃度

8、均為8mg/L。同樣方法制備三個96孔板，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，MTT法檢測吸光度，比較相同作用時間下，細胞接種密度對DDP抑制率的影響，選擇細胞的最佳接種方式。
　　 4.3檢測藥物對細胞增殖的影響：按Table1和Table2所示的實驗分組和細胞接種方式，觀察bigelovin和DDP對SK-OV-3、SK-OV-3/DDP及PBMC細胞體外增殖的影響，計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)、耐藥指數(shù)和效能比，評價b

9、igelovin對上皮性卵巢癌細胞的藥效。
　　 5、流式細胞術(shù)：碘化丙啶(PI)標(biāo)記的流式細胞術(shù)(FCM)檢測bigelovin對SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細胞周期的影響。實驗分組如下：Bigelovin(0μ M、2μ M、4μ M、8μ M)作用于SK-OV-3細胞24h，(0μ M、4μ M、8μ M、16μ M)作用于SK-OV-3/DDP細胞72h。
　　 6、應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分

10、析。
　　 結(jié)果：
　　 1、倒置顯微鏡觀察：SK-OV-3及SK-OV-3/DDP細胞均呈貼壁生長，SK-OV-3細胞呈梭形，上皮細胞樣生長，邊界清楚，折光性好。SK-OV-3/DDP細胞呈扁平的多角形，“鋪路石”狀，邊界模糊，折光性差。PBMC呈圓形，大小不均一，體積與SK-OV-3及SK-OV-3/DDP細胞相差較大，靜置2h后可輕微貼壁，但不變形。Bigelovin處理SK-OV-3及SK-OV-3/DDP細胞后

11、，細胞密度較對照組低，光澤度下降，出現(xiàn)細胞凋亡特征；Bigelovin處理PBMC細胞24h、48h后細胞變化不大，72h后細胞光澤度下降，細胞數(shù)較對照組減少，胞膜皺縮明顯。上述細胞凋亡變化隨藥物濃度和作用時間的增加而逐漸明顯。
　　 2、MTT法檢測結(jié)果
　　 2.1最佳接種密度：在200μ L培養(yǎng)液條件下，SK-OV-3細胞24h、48h、72h的最佳接種密度分別選擇6×104/mL、3×104/mL、1.5×104

12、/mL；SK-OV-3/DDP細胞24h、48h、72h的最佳接種密度分別選擇8×104/mL、5×104/mL、3×104/mL；PBMC72h接種密度選擇50×104/mL。
　　 2.2最佳接種方式：同一觀察時間下，細胞以最佳密度接種所得的DDP抑制率，與非最佳細胞密度接種所得的抑制率相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，接種密度對抑制率有影響；在三個觀察時間點最佳接種密度條件下，所得的抑制率標(biāo)準(zhǔn)差均為最小，最佳接種密度

13、下所得的抑制率均數(shù)能更好得代表DDP對細胞的抑制作用。故以各時間點細胞的最佳接種密度觀察bigelovin和DDP的抑制作用是最佳接種方式。
　　 2.3藥物對細胞增殖的影響
　　 2.3.1 DDP：DDP對SK-OV-3細胞系24h、48h、72h的IC50分別為14.622mg/L、7.999 mg/L、2.176mg/L；對SK-OV-3/DDP細胞系24h、48h、72h的IC50分別為23.375 mg/L、

14、13.695 mg/L、4.899mg/L，對PBMC細胞72h的IC50為14.922 mg/L。SK-OV-3/DDP細胞系的DDP平均耐藥指數(shù)為1.854，小于建株者提供的耐藥指數(shù)。DDP作用72h對SK-OV-3細胞的效能比為6.858，對SK-OV-3/DDP細胞的效能比為3.046。在一定時間和濃度范圍內(nèi)，DDP對卵巢癌細胞抑制作用存在時間一劑量依賴性，對正常二倍體細胞生長的抑制作用存在劑量依賴性。
　　 2.3.2

15、 Bigelovin：Bigelovin對SK-OV-3細胞24h、48h、72h的IC50分別為6.643μ M、2.176μ M、0.940μ M；對SK-OV-3/DDP細胞的IC50分別為70.352μM、44.573μ M、15.933μ M；對PBMC細胞72h的IC50為21.933μ M。Bigelovin對SK-OV-3/DDP細胞24h、48h時IC50大于其體外藥效評價標(biāo)準(zhǔn)32.895μ M，故僅作用72h評價為有

16、效。SK-OV-3/DDP細胞系對bigelovin的耐藥指數(shù)為16.950，是DDP耐藥指數(shù)的8.634倍；Bigelovin作用72h對SK-OV-3細胞的效能比為23.333，對SK-OV-3/DDP細胞的效能比為1.377。在一定時間和濃度范圍內(nèi)，bigelovin對DDP敏感卵巢癌細胞抑制作用存在時間一劑量依賴性，對DDP耐藥上皮性卵巢癌細胞和正常細胞的抑制作用存在劑量依賴性。
　　 3、FCM檢測顯示：Bigelov

17、in可將SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細胞阻滯于G2/M期，且G2/M期和S+G2/M期細胞比例隨藥物濃度的升高而升高。
　　 結(jié)論：
　　 1、用MTT比色法進行體外抗癌藥物篩選時，接種密度對藥物的抑制率有影響，應(yīng)選擇各時間點細胞的最佳接種密度觀察藥物的抑制作用；
　　 2、卵巢癌體外抗癌藥物篩選不應(yīng)選擇正常卵巢上皮細胞或正常子宮內(nèi)膜細胞作為二倍體對照，外周血單個核細胞是一個較理想的選擇；
　　

18、 3、Bigelovin對DDP敏感型上皮性卵巢癌(EOC)細胞株的選擇性抑制作用優(yōu)于DDP，可進一步做體內(nèi)實驗，以明確其對DDP敏感型EOC的治療作用；
　　 4、Bigelovin對DDP耐藥型EOC細胞株的抑制作用較差，與DDP存在交叉耐藥，不宜單獨用于DDP耐藥EOC的治療；
　　 5、Bigelovin可將SK-OV-3和SK-OV-3/DDP細胞系阻滯于G2/M期，可能是bigelovin抑制EOC細胞增殖的