1、目的:自天然螺旋藻粉中純化出高純度藻藍蛋白亞基;確定藻藍蛋白亞基PDT致腫瘤細胞死亡的最佳劑量;制備鑒定純化PRAS40-S183磷酸化多克隆抗體;探究PC亞基PDT介導細胞凋亡對凋亡相關蛋白PRAS40、LKB1表達量及磷酸化水平的影響。
　　方法:鹽溶、鹽析、離心、SEPHADEX G-75柱層析分離純化藻藍蛋白,紫外-可見分光光度計全波長掃描檢測純度,SDS-PAGE紫外檢測亞基狀態(tài),透析除鹽、凍干備用;正常培養(yǎng)人胚胎腎細胞

2、HEK293、人肺癌細胞A549,以系列濃度PC亞基(0,25,50,75,100,125,150,200μg/mL)、30J/cm2光照處理上述細胞8min,MTT法檢測細胞死亡情況,確定致非腫瘤細胞最大限度生存、腫瘤細胞最大限度死亡的最佳PDT劑量范圍,在此范圍內吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察計數確定致最大細胞凋亡率的最佳PDT劑量;通過蛋白疏水性抗原性分析設計多肽抗原,用其免疫家兔獲得抗血清,ELISA檢測其效價,用rProtein A

3、 Sepharose親和層析純化并經非磷酸化的抗原條吸附處理后的抗體,Western Blot法檢測正常細胞HL7702、HEK293及腫瘤細胞HepG2、A549、S180,經饑餓處理HEK293細胞觀察S183磷酸化水平變化;Western blot檢測PC亞基PDT對A549細胞LKB1、PRAS40量變及磷酸化水平的影響。
　　結果:紫外可見分光光度計檢測表明純化出高純度藻藍蛋白,SDS-PAGE紫外顯示為亞基混合物;MT

4、T法得知低劑量PDT(PC亞基濃度25μg/mL)可以促進細胞生長;高劑量的PDT可以導致細胞死亡;在光照功率恒定的情況下,A549人肺癌細胞的半數致死PC亞基濃度約為60μg/mL,HEK293非腫瘤細胞的半數致死PC亞基濃度約為120μg/mL;最佳PDT劑量范圍是光照30J/cm2,8min，PC亞基濃度75μg/mL和100μg/mL,以吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察計數計算得知,致高凋亡率最佳PDT劑量是光照30J/cm2,8min

5、,PC亞基濃度100μg/mL;通過蛋白疏水性抗原性分析設計多肽抗原TQQYAKpS183LPV,用其免疫家兔獲得抗血清,ELISA檢測其效價為1:10000;用rProtein A Sepharose親和層析純化并經非磷酸化的抗原條吸附處理后的抗體,Western Blot法檢測發(fā)現,該處理可以明顯提高磷酸化抗體的特異性;對正常細胞HL7702、HEK293及腫瘤細胞HepG2、A549、S180的檢測顯示,磷酸化的Ser183在不同

6、細胞中表達的差異不顯著;而經細胞饑餓處理的HEK293細胞中卻明顯觀察到了S183磷酸化水平隨氨基酸含量的降低而減弱的現象;由Western blot知,隨著細胞凋亡率改變,pT336-LKB1即失活LKB1的量未見明顯變化,但是LKB1蛋白總量卻與其成負相關,說明有正常功能的LKB1蛋白隨著細胞凋亡的發(fā)生而量增,此與LKB1的性質相符合,伴隨低劑量PDT作用導致的細胞增殖,正常LKB1的量也相應的減少,PRAS40蛋白總量未隨PDT劑

7、量增加而產生明顯變化,伴隨高劑量PDT導致細胞凋亡,S183位點的磷酸化出現減少,然而,在低劑量致細胞增殖的PC亞基PDT作用下,S183位點的磷酸化水平未出現明顯變化。
　　結論:高劑量PC亞基PDT可以導致細胞凋亡,在此細胞凋亡中LKB1、PRAS40蛋白參與了調控,抑癌蛋白LKB1通過總量不變減少失活的T336位點磷酸化的LKB1來達到抑制細胞增殖導致凋亡,PRAS40通過去磷酸化自身S183位點達到抑制mTORC1進而促進