1、南方醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文腺相關(guān)病毒介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)移抑制角膜新生血管的研究姓名：湯明芳申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：陸曉和20080428中文摘要害作用，免疫反應(yīng)小，能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂、非分裂細(xì)胞，產(chǎn)生長期基因表達。近來研究證實重組腺相關(guān)病毒用于眼部轉(zhuǎn)基因可長期表達，已用于多種視網(wǎng)膜細(xì)胞，包括光感受器、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、Mtiller氏細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。以往研究結(jié)果顯示：rAAVl、rAAV5在人、鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和鼠動

2、脈段轉(zhuǎn)基因時較rAAV2、rAAV3、rAAV4具有更高的轉(zhuǎn)染效率和更好的表達。而且rAAVl轉(zhuǎn)染人主動脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)時也優(yōu)于其他血清型腺相關(guān)病毒載體。其結(jié)果提示重組腺相關(guān)病毒載體1、5是獨特的、有潛力的血管靶基因治療的載體。rAAV是迄今為止公認(rèn)的最具廣泛應(yīng)用前景的病毒載體。本研究擬用rAAVl載體攜帶內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染角膜基質(zhì)細(xì)胞和ECV304細(xì)胞，來抑制角膜新生血管增生。因此，展開以下研究(1)利用rAAVl載體攜帶增強

3、型綠色熒光蛋白(EGFP)基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304細(xì)胞)株；檢測rAAVl的轉(zhuǎn)染率。(2)單純和聯(lián)合采用結(jié)膜下注射rAAVlEGFP轉(zhuǎn)染液或轉(zhuǎn)染液局部浸泡角膜的途徑轉(zhuǎn)移基因，通過整體熒光體視鏡和激光共聚焦顯微鏡的觀察、監(jiān)測r從V1EGFP在活體動物模型中角膜上的表達，驗證此轉(zhuǎn)染途徑的有效性。(3)以rAAVl攜帶的人內(nèi)皮抑素(ES)基因?qū)虢悄せ|(zhì)細(xì)胞和ECV304細(xì)胞中；分析轉(zhuǎn)染rAAVJES后細(xì)

4、胞中ES蛋白表達、分泌及對ECV304細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。(4)建立炎性大鼠CNV的動物模型，觀察單獨和聯(lián)合使用轉(zhuǎn)染液rAAVlES結(jié)膜下注射及局部浸泡去上皮角膜途徑轉(zhuǎn)染rAAVlES對角膜新生血管增生的抑制作用。本研究目的是為基因轉(zhuǎn)染角膜選擇具有廣泛應(yīng)用前景的病毒載體；為轉(zhuǎn)基因治療角膜新生血管病變提供簡便的、更有效的轉(zhuǎn)染途徑。方法1細(xì)胞培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞。取6只SD大鼠角膜，刮去角膜上皮層，分離外周