1、骨關(guān)節(jié)炎(OA)是由多種因素引起的關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)骨贅形成并伴隨關(guān)節(jié)周圍滑膜炎癥的一種關(guān)節(jié)疾病。年齡、肥胖、性別、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、炎癥、遺傳等多種因素都參與到OA的發(fā)生及進(jìn)展中，但是目前OA的發(fā)病分子機(jī)制尚不明確。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路以及蛋白酶類、microRNA、轉(zhuǎn)錄因子、補(bǔ)體等不同類型的信號(hào)通路和分子都參與到OA的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中。
　　細(xì)胞衰老是多種退行性疾病發(fā)生的根源。衰

2、老的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞周期停滯，代謝減緩并且分泌大量的基質(zhì)降解酶類。包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種外在應(yīng)激刺激都可能引起細(xì)胞衰老，稱之為應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老。p53不僅是著名的腫瘤抑制蛋白，它還作為應(yīng)答外在刺激的重要效應(yīng)分子參與調(diào)控細(xì)胞的衰老。氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損傷可以引起p53的活化，活化后的p53一方面通過(guò)調(diào)控促氧化酶類和抗氧化酶類的表達(dá)，降低細(xì)胞自身的抗氧化能力，另一方面則通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制蛋白p21和p16的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，從而參與

3、調(diào)控細(xì)胞衰老。
　　OA的發(fā)生被認(rèn)為與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的衰老密切相關(guān)。臨床OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生了顯著的衰老現(xiàn)象。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)軟骨細(xì)胞受到異常的應(yīng)激刺激時(shí)，異常的代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇(ROS)。當(dāng)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS的水平超過(guò)自身抗氧化能力時(shí)，就會(huì)引起端粒縮短、細(xì)胞大量分泌基質(zhì)降解酶類，導(dǎo)致衰老的發(fā)生。這與在OA患者中觀察到軟骨細(xì)胞的衰老表型相一致，但是在體內(nèi)，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生的分子機(jī)制尚未闡明，氧化應(yīng)激所致的

4、軟骨細(xì)胞衰老與OA發(fā)生及進(jìn)展之間的確鑿因果關(guān)系也需進(jìn)一步明確。
　　10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)是一個(gè)重要的抑癌分子，它通過(guò)負(fù)向調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的功能，抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt的磷酸化活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等等。體外研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)的合成并抑制凋亡的發(fā)生。因此，人們普遍認(rèn)為PI3K/Akt信號(hào)通路的激活在OA發(fā)生中可能具有積極的

5、作用。但在進(jìn)化過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路最保守的功能卻是調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝并進(jìn)一步?jīng)Q定細(xì)胞壽命。在多種生物體中都已證實(shí)，通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，降低細(xì)胞代謝速率從而延緩細(xì)胞衰老。那么，在OA的發(fā)生及進(jìn)展中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路是否發(fā)生激活？持續(xù)激活的PI3K/Akt信號(hào)通路是增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞修復(fù)和抗凋亡的能力、促進(jìn)胞外基質(zhì)的合成，從而抑制OA的發(fā)展，還是使軟骨細(xì)胞走向早衰的境地，乃至起始OA的發(fā)生？
　

6、　發(fā)現(xiàn)人類OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Pten的表達(dá)普遍升高，表明人OA患者中PI3K/Akt信號(hào)通路出現(xiàn)了異常活化。在對(duì)大鼠半月板切斷術(shù)(DMM)誘發(fā)OA的模型中，同樣檢測(cè)到術(shù)后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中磷酸化Akt和磷酸化Pten迅速且持續(xù)的高表達(dá)。這兩方面結(jié)果提示PI3K/Akt信號(hào)通路的異?；罨贠A的發(fā)生及進(jìn)展中存在普遍性。為了確證PI3K/Akt信號(hào)通路的持續(xù)激活是否是OA發(fā)生的直接原因，通過(guò)軟骨細(xì)胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小

7、鼠（Col2a-Cre）和Pten條件打靶小鼠（Pterfl/fl）交配，獲得了在軟骨細(xì)胞中特異性Pten基因敲除小鼠（Col2a-Cre？Ptenfl/fl）。Pten敲除小鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路持續(xù)激活，成年的Pten敲除小鼠逐步表現(xiàn)出駝背、步履蹣跚、關(guān)節(jié)僵硬等OA大體表現(xiàn)。通過(guò)番紅“O”染色，觀察到Pten敲除小鼠發(fā)生了與人類OA十分類似的疾病表型:Pten敲除小鼠1月齡時(shí)關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，未有明顯異常改變;4

8、月齡時(shí)關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨表面略顯粗糙;8月齡時(shí)就可以明顯的觀察到關(guān)節(jié)軟骨區(qū)域性的磨損脫落;12月齡時(shí)則大部分關(guān)節(jié)軟骨磨損殆盡，裸露出軟骨下骨。對(duì)8周Pten敲除小鼠實(shí)施DMM則加速了OA的發(fā)生，使OA的病理表現(xiàn)提前。此外，還在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中敲除了Akt1，阻斷其介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路。軟骨細(xì)胞特異性Akt1敲除小鼠的關(guān)節(jié)軟骨與野生型對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異，但是在DMM手術(shù)誘發(fā)OA的情況下，Akt1敲除小鼠術(shù)后關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)仍舊保持完整，

9、關(guān)節(jié)表面的磨損明顯減輕，表明阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的活化可有效抑制OA的發(fā)生。綜合上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，首次提供了遺傳學(xué)證據(jù)證明了PI3K/Akt信號(hào)通路異常與OA發(fā)生的因果關(guān)系。
　　接下來(lái)通過(guò)OxyIHC和OxyBlot的方法檢測(cè)到Pten敲除小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中蛋白質(zhì)發(fā)生氧化的程度比野生型對(duì)照更為顯著。同樣也在DMM誘發(fā)OA的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化程度顯著升高的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)氧化程度升高提示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激

10、的發(fā)生。氧化應(yīng)激的發(fā)生是誘發(fā)細(xì)胞衰老的重要原因之一。通過(guò)SA-β-gal衰老染色以及對(duì)衰老指示分子磷酸化p53的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，Pten敲除小鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生了顯著的衰老現(xiàn)象，而在DMM誘發(fā)OA的小鼠模型中也檢測(cè)到了發(fā)生早衰的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一種抗氧化劑，可以有效阻斷氧化應(yīng)激的發(fā)生。發(fā)現(xiàn)通過(guò)持續(xù)灌注NAC藥物有效地抑制了Pten敲除小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的衰老，并阻斷了Pten敲除小鼠的OA表型。這些結(jié)果表