1、目的：Graves病(Graves disease，GD)是一種常見的自身免疫性疾病，遺傳學(xué)因素在其發(fā)生過程中起著重要的作用。Graves病的發(fā)生呈明顯的家族聚集性，病人家族成員的患病危險性為普通人群的15倍，同卵雙生子的患病一致率明顯高于異卵雙生子，且作為自身免疫性甲狀腺病(Autoimmune Thyroid Disease，AITD)標(biāo)志的甲狀腺自身抗體的陽性率在病人家族成員中高達(dá)50-70％。對復(fù)雜多基因疾病易感基因的研究常參照

2、單基因疾病的研究模式，即基于家系成員的連鎖分析和基于隨機人群的關(guān)聯(lián)研究。 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指的是基因組序列上的單個堿基突變。作為第三代遺傳學(xué)標(biāo)記，SNP在疾病易感基因的研究中有著重要的意義，尤其是處于基因調(diào)控區(qū)或基因編碼區(qū)的SNPs本身可直接導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)數(shù)量或質(zhì)量的改變。最近的研究表明，人類基因組中的SNPs并不是隨機分布的，而是呈現(xiàn)出由重組熱點區(qū)間隔的單倍

3、型域結(jié)構(gòu)(haplotype block，HaploBlock)，每個單倍型域內(nèi)部連鎖不平衡(Linkage Disequilibriurn，LD)程度較高，且僅有數(shù)種常見的單倍型。如果導(dǎo)致疾病發(fā)生的突變位于LD程度很高的單倍型域內(nèi)，那么該突變的頻率應(yīng)該與該區(qū)域內(nèi)所檢測的突變的頻率相一致，或至少與由檢測的SNPs確定的單倍型的頻率一致。 本研究所的金迎等人曾利用54個北方漢族多發(fā)家系標(biāo)本通過全基因組掃描的方法，將中國人GD病的易

4、感位點定位于染色體5q31區(qū)(D5S436-D5S434)，這與日本學(xué)者Sakai等人對受累同胞對的研究結(jié)果相一致，但與Tomer等人對西方高加索人群的結(jié)果存在差異，這提示，東亞人群可能有著相同的Graves病易感位點。本研究的目的就在于在染色體5q31區(qū)附近對Grayes病的易感位點進(jìn)行深入研究，探討可能與Graves病發(fā)生有關(guān)的相關(guān)基因或SNPs位點，并研究在特定SNPs位點不同基因型患者臨床參數(shù)差異。同時，構(gòu)建中國漢族人群染色體5

5、q31區(qū)的單倍型域結(jié)構(gòu)，確定其中具有代表性的tagSNPs，并比較Graves家系先證者與正常個體主要單倍型分布上的差異，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 為了進(jìn)一步探索Graves病的易感位點，我們在染色體5q31區(qū)Graves病易感位點定位區(qū)域?qū)L4、IL13、IL12B、IRF1、LJGRP1等可能與Graves病發(fā)生有關(guān)的14個候選基因的所有編碼區(qū)和約1，000bp的啟動子區(qū)進(jìn)行了測序，篩查其中的SNPs，

6、并對在篩查中可能存在差異的SNPs位點在擴大的家系樣本或隨機人群中進(jìn)行驗定。根據(jù)目前對Graves病發(fā)病機制的認(rèn)識，我們對上述候選基因中的IL4、IL13、IL12B、IRF1、UGRP1和ADRB2等基因進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，包括擴大樣本的關(guān)聯(lián)研究、構(gòu)建單倍型域、家系內(nèi)的傳遞不平衡檢驗和不同基因型患者臨床參數(shù)的比較。 我們還從D5S436和D5S434這兩個微衛(wèi)星標(biāo)記之間，挑選了74個低頻等位基因超過20％，且位于基因編碼區(qū)或

7、啟動子區(qū)周圍的SNPs，通過焦磷酸測序的方法，構(gòu)建中國漢族人群這段染色體區(qū)域的單倍型域結(jié)構(gòu)，并確定其中具有代表性的tagSNPs，為下一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。 結(jié)果： 對染色體5q31區(qū)14個Graves病候選基因的篩查，測序總長度為63,498bp，共發(fā)現(xiàn)116個SNPs，其中基因編碼區(qū)17個，基因調(diào)控區(qū)35個。約每550bp堿基出現(xiàn)一個SNP，基因調(diào)控區(qū)或內(nèi)含子區(qū)的SNPs的密度高于基因編碼區(qū)。檢出的116個SNPs

8、中，轉(zhuǎn)換與顛換的比例約為2：1。對IL12B和ADRB2較大樣本的研究表明，IL12B基因的rs2853697A/C SNP在GD患者與正常個體間的分布存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0．0024，Pc=0．0168)，其余位點未發(fā)現(xiàn)差異。 利用54個GD多發(fā)家系標(biāo)本、146名散發(fā)GD患者和142名無關(guān)對照個體，對IL4、IL13、IRF1和IJGRP1與中國人GD的發(fā)病進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，無論是隨機樣本還是家系成員中，均未發(fā)現(xiàn)這些基因的

9、SNPs與Graves病的發(fā)病之間具有統(tǒng)計學(xué)的相關(guān)性或從雜合型父母向受累子代的優(yōu)勢傳遞。對IRF1和UGRP1基因的單倍型研究也未發(fā)現(xiàn)差異，但在IRF1 6477 T/G位點，基因型為TT的Graves病患者的發(fā)病年齡為37.73±11.69歲，要早于基因型為TG(42.16±13.75)或GG(43.24±15.20)的患者，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005，Pc=0.020)。對染色體5q31區(qū)(D5S436-D5S434)構(gòu)建單倍

10、型域的結(jié)果表明，這段染色體區(qū)域可以分為8個獨立的單倍型域結(jié)構(gòu)，最長的單倍型域長達(dá)77kb。在每個單倍型域的內(nèi)部，染色體的重組事件發(fā)生較少，僅含有少數(shù)(1-4)幾種主要的單倍型。而且，每個單倍型域的結(jié)構(gòu)，可以通過少數(shù)幾個具有代表性的tagSNPs來決定。這表明，在今后的研究中，可以僅通過對這些tagSNPs進(jìn)行分型，即可確定待測樣本的整個單倍型域結(jié)構(gòu)。而且，在第6個單倍型域中的AGCGTC單倍型和第8個單倍型域結(jié)構(gòu)中的GGCCT單倍型在G

11、D多發(fā)家系的先證者和正常個體間的分布具有統(tǒng)計學(xué)差異(p值為0.0064.和0.0274，前者校正后為Pc=0.0256)。 結(jié)論： 1、篩查的14個候選基因中SNPs的頻率約為每550bp一個，啟動子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)出現(xiàn)頻率較高，SNP中轉(zhuǎn)換與顛換的比例約為2：1。 2、IL12B的rs2853697位點可能與中國人Graves病相關(guān)聯(lián)。 3、ADRB2基因與中國人Graves病并不具有相關(guān)性。 4、

12、IL4、IL13、IRF1和UGRP1基因與中國漢族人GD的發(fā)生并不具有相關(guān)性。 5、在IRF1 6477 T/G位點基因型為TT的GD患者的發(fā)病年齡要早于基因型為TG或GG的患者。 6、中國漢族人群的染色體5q31區(qū)的D5S436-D5S434具有典型的單倍型域結(jié)構(gòu)，其中最長的單倍型域長達(dá)77kb。在每個單倍型域結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，染色體的重組事件較少發(fā)生，僅含有少數(shù)幾種主要的單倍型。且每個單倍型域的結(jié)構(gòu)可以由少數(shù)幾個具有代表