1、背景與目的:
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動脈硬化中常見的最重要的一種，其特點是受累動脈病變從內(nèi)膜開始[1-3]。一般先有脂質(zhì)和復合糖類積聚、出血及血栓形成，纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，并有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化，病變常累及彈性及大中等肌性動脈，一旦發(fā)展到足以阻塞動脈腔，則該動脈所供應的組織或器官將缺血或壞死。由于在動脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣，因此稱為動脈粥樣硬化。[4]動脈粥樣硬化是西方發(fā)達

2、國家的主要死亡原因，隨著我國人民生活水平提高和飲食習慣改變，該病也成為我國主要死亡原因。動脈粥樣硬化始發(fā)兒童時期而持續(xù)進展，通常在中年或者中老年出現(xiàn)癥狀。由于動脈粥樣硬化斑塊表現(xiàn)為脂質(zhì)和壞死組織的驟聚，因此往往認為動脈粥樣硬化是退行性病變。現(xiàn)在認為，本病變是多因素共同作用的結果，[5，6]首先是病變處中性粒細胞、血小板、巨噬細胞、及T淋巴細胞的聚集;其次是包括膠原、彈性纖維及蛋白質(zhì)多糖等結締組織基質(zhì)和平滑肌細胞的增生;第三是脂質(zhì)，其中主

3、要含膽固醇結晶及游離膽固醇和結締組織。粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)及結締組織的含量決定斑塊的穩(wěn)定性以及是否易導致急性缺血事件發(fā)生。
　　 LDL透過內(nèi)皮細胞深入內(nèi)皮細胞間隙，單核細胞遷入內(nèi)膜，此即最早期。Ox-LDL與巨噬細胞的清道夫受體結合而被攝取，形成巨噬源性泡沫細胞，對應病理變化中的脂紋。動脈中膜的血管平滑肌細胞(SMC)遷入內(nèi)膜，吞噬脂質(zhì)形成肌源性泡沫細胞，增生遷移形成纖維帽，對應病理變化中的纖維斑塊。ox-LDL使上述兩種泡沫細

4、胞壞死崩解，形成糜粥樣壞死物，粥樣斑塊形成。從上述動脈粥樣硬化形成的機理可以得知:關鍵環(huán)節(jié)在于ox-LDL，如何防止LDL被氧化成ox-LDL就成了治療和防止動脈粥樣硬化的核心[7-9]。
　　 芥菜籽(mustardseed，MS)又名芥子，是十字花科蕓苔屬植物芥菜的種子，含有芥子油、芥子黏液、多糖和β-谷甾醇等活性成分，其加工的產(chǎn)品芥末油和芥末粉是我們生活中常用的調(diào)味品。近年來對芥菜籽提取物的研究發(fā)現(xiàn)，芥菜籽不但是良好的天然

5、抗氧化劑，而且具有獨到的抗衰老功效[4]。而在東方的日本，世界上人均壽命最長的國家，人們普遍有食用芥末的習慣。而中國傳統(tǒng)醫(yī)學更認為白芥（芥菜籽的一種）具有防腐，消積化滯的功效[10-12]。因此明確白芥是否具有抗氧化和防治動脈粥樣硬化的作用，有利于我們開發(fā)中西方普遍接受的保健食品和藥品。
　　 盡管利用小鼠模型在研究人類疾病中取得了顯著的成果，但是由于小鼠自身的生物學特性，使其在遺傳學[13]，生物發(fā)育學和疾病模型的研究中的應用

6、有一定的局限性。[14]斑馬魚(Daniorerio)是屬于輔鰭亞綱(Actin(O)pterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔尼魚屬（Danio）的一種硬骨魚，原產(chǎn)于印度東部、巴基斯坦、緬甸及孟加拉國，因其體側具有像斑馬一樣縱向的暗藍與銀色相間的條紋而得名。斑馬魚繁殖能力強，每對成魚每周可產(chǎn)300枚受精卵，能快速獲得大量胚胎，其胚胎透明，易于活體觀察，生長發(fā)育快，受精24h后主要器官原基基本形成，便于研究組織器官的發(fā)育和功能[

7、15-17]。因此，斑馬魚成為理想的研究脊椎動物發(fā)育的模式動物之一，在心血管疾病中血栓、動脈血管形成、炎癥、心肌病、心臟再生[18]和先天性心血管疾病等研究中大量應用。
　　 材料與方法:
　　 1.斑馬魚:所有動物都是在南方醫(yī)科大學倫理委員會的管理條例下處理的。轉基(墨)斑馬魚Tg(flk1:cherry)，Tg(lyz∶DsRed)和Tg(coroninala∶eGFP)由香港科技大學溫子龍教授饋贈，其他種類的斑馬魚

8、來自南方醫(yī)科大學細胞生物學教研室中港聯(lián)合實驗室。AB魚是野生型斑馬魚，做為所有實驗的陰性對照;Tg(fli1:eGFP)，轉基(墨)斑馬魚，綠色熒光蛋白標記轉錄因子ERGB，特異性的標記血管內(nèi)皮細胞;Tg(flk1:cherry)，轉基(墨)斑馬魚，cherry蛋白標記內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR-2），也是特異性標記內(nèi)皮細胞;Tg(lyz∶DsRed)，DsRed標記溶解酶3(lysozyme-3)，在粒細胞中表達;Tg(cor

9、oninala∶eGFP)，轉基(墨)斑馬魚，綠色熒光蛋白標記冠蛋白(coronin)，這是一種肌動蛋白結合蛋白，與微管相互作用，標記巨噬細胞。
　　 2.飼料:將普通飼料與不同含量的膽固醇溶解在乙醚中(主要是3％HCD)，充分攪拌至乙醚揮發(fā)，60℃烤箱烘干，然后研磨至直徑100μm大小的顆粒，分裝。新鮮的芥菜籽，粗壓榨，手工攪拌器攪拌研磨，加入高膽固醇飼料中[19]，制備出不同芥菜籽含量的芥菜籽膽固醇飼料，主要是3％HCD+2

10、.5％MS和3％HCD+5％MS。試驗中，依替米貝(ezetimibe)為芥菜籽陽性對照藥物，它通過抑制腸道膽固醇的吸收來降低血膽固醇，在每次加入飼料之前直接加入水中。
　　 3.斑馬魚的繁殖與喂養(yǎng):斑馬魚養(yǎng)殖在自來水純化系統(tǒng)中，每天接受14小時光照，10小時黑暗環(huán)境，斑馬魚3個月達性成熟，體外受精，雌雄斑馬魚的交配行為受光刺激，收集受精卵，培養(yǎng)與培養(yǎng)皿中，5dpf大小轉至500ml小缸，開始喂養(yǎng)，每天三次，喂養(yǎng)十五天。

11、　　 4.圖像分析:斑馬魚固定，在奧林巴斯熒光共聚焦顯微鏡(FV10-ASW1.7，Tokyo，Japan)下成像，并利用奧林巴斯自帶圖像分析軟件對平均熒光密度(MIF)進行測量和分析。為了保證斑馬魚在拍攝過程中是存活的，將斑馬魚包埋并麻醉在含有0.02％三卡因的0.5％低熔點瓊脂糖中。
　　 5.斑馬魚組織勻漿:在實驗終止階段，將每組50條斑馬魚長時間暴露在高濃度的三卡因溶液中至安樂死，并將動物腹中未消化的食物清除，然后將其

12、浸泡在200ul冰PBS中，利用勻漿器勻漿，并將所得的組織液利用0.45μm濾器過濾，收集勻漿液，待測。
　　 6.脂質(zhì)分析:利用南京建成公司的臨床診斷試劑盒，比色法測得各組勻漿液的總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL)，總甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL)濃度，并進行統(tǒng)計分析。
　　 7.LPO和SOD:測量各組脂質(zhì)過氧化物(LPO)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活力，也是利用的南京建成臨床診斷試劑盒檢測。MD

13、A是LPO中最主要也是最容易測量的一種，所以我們測得MDA濃度來衡量LPO濃度。
　　 8.統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（-x±s）表示，用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，兩兩比較方差齊性時采用LSD方法，方差不齊時采用Dunnett3法，P＜0.05即被認為在統(tǒng)計學上有差異。*:p＜0.05，**:p＜0.01;***:p＜0.001。
　　 結果:
　　 1.3％HCD可

14、以誘導出血管脂質(zhì)堆積。
　　 分別用0％-8％HCD喂養(yǎng)5dpf,fli1-eGFP的斑馬魚幼魚10天(正常飼料、2％、3％、4％、6％、8％HCD)，所有飼料都加有10μg/g的紅色熒光磷脂(cholesterylBODIPY(R)576/589C11;Invitrogen)，用來牢固標記膽固醇，以便活體內(nèi)觀察膽固醇的走向與血管壁內(nèi)的沉積。15dpf幼魚，利用含有三卡因的低熔點瓊脂糖固定，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察尾部靜脈血管及

15、紅色熒光磷脂堆積情況（40倍物鏡，488nm和559nm激發(fā)光），并對各組紅色熒光密度進行定量?？梢园l(fā)現(xiàn)正常幼魚尾部幾乎無紅色熒光，其他各組幼魚有不同程度的紅色熒光聚集，隨著膽固醇含量的增加，熒光密度越大，面積也越大。但是3％HCD可以誘導出穩(wěn)定的紅色熒光磷脂堆積，所以以后的實驗我們將膽固醇的濃度定為3％。以上結果可以說明我們復制出了動脈粥樣硬化的斑馬魚模型，下一步也將利用這一模型研究芥菜籽有無抗動脈粥硬化功能。補充說明，我們之所以觀察

16、斑馬魚的尾部靜脈血管而不是大動脈的原因是斑馬魚的血管結構，在幼魚階段斑馬魚動脈和靜脈直接想接，而沒有毛細血管網(wǎng)，靜脈血流也很迅速，另外的原因是幼魚尾部組織很薄更易于在顯微鏡下觀察。
　　 2.芥菜籽可以降低脂質(zhì)堆積面積。
　　 芥菜籽對膽固醇誘導的脂質(zhì)堆積有無影響呢？所以我們在3％HCD飼料中加入不同含量的芥菜籽，2.5％、5％、7.5％和10％MS，正常飼料、依替米貝和單純3％HCD飼料作為對照，同樣膽固醇被紅色熒光磷

17、脂標記。喂養(yǎng)5dpf,fli1-eGFP幼魚10天，confocal下觀察，我們發(fā)現(xiàn)2.5％和5％MS組紅色熒光磷脂減少，雖然7.5％和10％MS也有抑制作用但是這兩組幼魚死亡率較高，所以我們選擇2.5％和5％MS作為藥物濃度。藥物對照依替米貝組也有同樣的降低紅色熒光磷脂聚集的結果。以上結果說明芥菜籽具有降低膽固醇堆積，抗動脈粥樣硬化的作用，但是它的作用機制是什么呢，是否與依替米貝的作用機制相同呢？
　　 3.芥菜籽和依替米貝對

18、血脂水平的影響不同。
　　 依替米貝又是公認的降血脂藥物，然而芥菜籽和依替米貝具有一致的降脂質(zhì)堆積作用，所以我們將比較芥菜籽干預和依替米貝干預下幼魚的血脂水平是否有差異。將各組幼魚隨機分出50條，組織勻漿，檢測各組幼魚整體的TC、C-LDL、TG和C-HDL。結果發(fā)現(xiàn)，芥菜籽不能降低整體TC、C-LDL和C-HDL，但是可以降低TG水平;而依替米貝具有幾乎相反的結果。以上結果證明芥菜籽與依替米貝抗動脈粥硬化的機制是不同的，它并不

19、能降低血脂濃度。查找文獻說明芥菜籽具有抗氧化功能，所以我們將進一步測定其在動脈粥樣硬化狀態(tài)下的整體抗氧化能力。
　　 4.芥菜籽可降低整體氧化產(chǎn)物LPO濃度，增強超氧化物歧化酶SOD活力。
　　 與正常飼料喂養(yǎng)組相比，3％HCD喂養(yǎng)組LPO濃度明顯升高，SOD活力明顯下降。EZE和MS組（2.5％和5％）均可以抵抗HCD飼料所導致的LPO的升高作用。可以確定芥菜籽具有極強的抗氧化能力。
　　 5.芥菜籽可以抑制中

20、性粒細胞的募集。
　　 眾所周知，AS是炎癥反應，炎癥的早期是中性粒細胞的參與過程[20，21]。所以我們將檢測不同組斑馬魚尾部的炎癥程度，它的嚴重程度我們利用尾部的中性粒細胞個數(shù)代表。Tg(fli1:eGFP)*Tg(lyz∶DsRed)是一種綠色熒光標記血管，紅色熒光標記中性粒細胞的雜交斑馬魚，分組喂養(yǎng)，終末檢測，并對尾部脂質(zhì)堆積部位進行紅色細胞的計數(shù)。可以發(fā)現(xiàn)，3％HCD組紅色細胞個數(shù)明顯增多，EZE組和MS組中性粒細胞數(shù)

21、和正常組相比無明顯變化。
　　 6.芥菜籽可以抑制巨噬細胞的聚集。
　　 泡沫細胞主要是來源于巨噬細胞，AS嚴重程度和進展速度與泡沫細胞的多少有密切關聯(lián)[7，8，22]。我們將利用另一種轉基因斑馬魚Tg(coroninala∶eGFP)（綠色熒光特異性標記單核細胞/巨噬細胞）來追蹤病變部位巨噬細胞的變化。結果可以發(fā)現(xiàn):與正常組相比，3％HCD組脂質(zhì)堆積部位有大量的巨噬細胞聚集，EZE組和MS組巨噬細胞數(shù)明顯減少。為了進一

22、步說明巨噬細胞堆積的部位是血管腔還是血管壁內(nèi)，我們利用利用另外一種Tg(flk1:cherry)*Tg(coroninala∶eGFP)轉基因斑馬魚，它是一種血管標記紅色熒光，巨噬細胞標記綠色熒光的斑馬魚，分組喂養(yǎng)結果顯示:3％HCD組，大量巨噬細胞和單核細胞貼附在血管壁上，而其他幾組貼附的巨噬細胞明顯下降。
　　 結論:
　　 1.3％HCD飼料連續(xù)喂養(yǎng)斑馬魚15天，可以復制出人類動脈粥樣硬化早期階段的斑馬魚模型，我們

23、利用這一模型可以觀察斑馬魚AS的早期病變，可以探索AS的早期發(fā)病機制，還可以用來篩選抗AS早期病變的藥物。
　　 2.芥菜籽與經(jīng)典的抗AS藥物依替米貝作用機制不同，它不能降低血脂含量但是芥菜籽可以降低LPO的濃度，增強整體SOD活力，從而進一步抑制LDL的氧化，具有抗動脈粥硬化的作用。
　　 3.芥菜籽可以抑制中性粒細胞和巨噬細胞向血管病變處募集，減輕AS早期炎癥程度，減少巨噬細胞的聚集，從而減少巨噬細胞的泡沫樣變，具有